Os autores gostariam de agradecer o apoio da Fundação Nacional de Pesquisa (NRF -NRFF2011-01 e NRF2015NRF-POC0001-19), o Conselho Nacional de Pesquisa Médica (NMRC / CBRG / 0005/2012), e Universidade Tecnológica de Nanyang para NJC

1. Formação da bicamada lipídica suportados sobre um suporte sólido Hidrofílico <ol><li> Preparar soluções de lípido de 10 mg / ml de 1,2-sn-glicero-dioleoyl- 3-fosfocolina (DOPC) e 1 mg / ml de 1,2-sn-glicero-dioleoyl- 3-phosphoethanolamine- N - (lissamina rodamina B sulfonil) (Rh-PE) por dissolução dos respectivos pós de lípidos (devidamente pesado previamente com um balanço de massa analítica) em solução de isopropanol. </li><li> Dilui-se e misturar as soluções de reserva em isopropanol a fim de preparar a mistura de lípidos desejada na concentração final. Para a microscopia de fluorescência e FRAP experiências, 0,5% em peso de Rh-PE deve ser incluído na mistura lipídica. </li><li> Injectar a mistura de lípidos em isopropanol para dentro do canal microfluídico até que seja preenchido. </li><li> Incubar a mistura de lípidos na superfície de vidro durante cerca de 10 min. </li><li> Substituir gradualmente a solução de lipidos com água ou solução de tampão utilizando uma bomba peristáltica a um caudal muito baixo(10-50 ul / min). Alternativamente, substituir a mistura de lípidos por pipetagem repetida. </li><li> Enxaguar minuciosamente o canal com o tampão em excesso, de modo a remover o isopropanol residual. </li></ol> 2. formação das membranas suportadas enriquecidas com colesterol Nota: A superfície sólida (SiO2) apoia fusão de vesícula, mas a composição da membrana (colesterol alto) inibe a fusão das vesículas porque vesículas enriquecidas com colesterol têm alta rigidez de flexão 30. <ol><li> Prepara-se uma solução de reserva contendo 10 mg / ml de lípido DOPC, 10 mg / ml de colesterol, e 1 mg / ml de Rh-PE dissolvendo em primeiro lugar os respectivos pós em isopropanol. </li><li> Repita os passos 1,2-1,6 utilizando as soluções de reserva preparada no passo 2.1. </li></ol> 3. Fluidez de Membrana Assay <ol><li> Imergir a lâmina de vidro na solução de sulfato de dodecil de sódio (SDS) (1%) durante 10 min. </li><li> Lavar as lâminas cuidadosamente com água deionizada e lave sagacidadeh etanol. </li><li> Seque slides usando uma corrente suave de azoto. </li><li> Expor os slides a plasma de oxigênio durante 30 segundos à potência máxima de radiofreqüência na câmara de plasma de oxigênio. </li><li> Remova o revestimento de película protetora do fundo comercial câmara microfluídicos (Figura 1A), usando uma pinça e coloque a lâmina de vidro para o lado pegajoso da câmara (Figura 1B). </li><li> Montar os conectores e tubagens para as posições de entrada e de saída da câmara e colocar o canal microfluídico na platina do microscópio (Figura 1C). </li><li> Formar uma bicamada lipídica fluorescentemente marcado suportado no canal microfluídico [repetir o passo 1, utilizando a composição de lípido desejada (por exemplo, 0,5 mg / ml de DOPC), incluindo 0,5% em peso de Rh-PE em solvente orgânico]. </li><li> Localizar o plano da bicamada com uma objectiva de imersão em óleo de 60X (NA 1.49), a fim de capturar as imagens. </li><li> Tome duas imagens pré-branqueamento, em seguida, foto-branqueador a 301; m de largura ponto circular com um feixe de laser de 532 nm mW, 100. Antes de fotodegradação, aquecer o laser até sua intensidade tornou-se estável. Imediatamente após a fotodegradação, captar uma série de imagens a cada 1 s durante 2 minutos, a fim de seguir a recuperação da intensidade de fluorescência no local branqueada. </li></ol> 4. O colesterol Quantificação Assay <ol><li> Expor o chip sensor de silício de cristal de quartzo revestido de dióxido de plasma de oxigénio durante 30 segundos à potência máxima de radiofrequência na câmara de plasma de oxigénio. Remover o chip da câmara e imediatamente montar o chip na câmara de medição. </li><li> Antes da experiência, em primeiro lugar adquirir a frequência e a dissipação do chip do sensor no ar, a fim de garantir uma montagem correcta. <ol><li> Para que o instrumento Q-Sense E1 ou E4 QCM-D comercial, execute o programa de software Q-Soft e clique em &quot;Aquisição&quot; e selecione &quot;Medição Setup&quot;. </li><li> Na nova janela que aparece, verifique a 3, 5, 7, 9, 11 e 13 tons e, em seguida, clique em Localizar e executar, a fim de verificar o espectro de ressonância. Definir a temperatura a 24 ° C. Se uma ou mais freqüências de ressonância não concordar com os valores esperados, verificar o chip de montagem e re-executar esta etapa até que seja alcançado um acordo. </li></ol></li><li> Comece a bomba peristáltica e o fluxo da solução tampão (10 mM Tris, 150 mM de NaCl, pH 7,5) para a câmara de medição a uma taxa de fluxo de 100 mL / min. </li><li> No programa de software, clique em &quot;Aquisição&quot; e selecione &quot;Restart Medição&quot;, a fim de gravar os sinais de dissipação de frequência de ressonância e de energia. Repita este passo até uma linha de base estável é obtido para os deslocamentos de frequência e de dissipação. Nota: Para ver as etapas a seguir, haverá deslocamentos de frequência e de dissipação adicional que pode ser registada como uma função do tempo. </li><li> Injectar isopropanol (sem lípido) durante 10 min. </li><li> Injectar a mistura de lípido DOPC / colesterol norazão molar desejada, com uma concentração de lípido total de 0,5 mg / ml em isopropanol, durante 10 min. </li><li> Injectar tampão durante 20 min a um caudal de 100 ul / min. </li><li> Injectar uma solução de 1 mM de metil-β-ciclodextrina (MβCD) preparado em tampão (caudal 100 l / min) até que o sinal de frequência atinge um valor estável. </li><li> Medir as mudanças de freqüência positivos relativos que é causada pela etapa de tratamento MβCD e calcular a massa de colesterol e DOPC lipídios, convertendo os valores Af cho e Af DOPC para valores de massa, usando a equação de Sauerbrey [Dm = - (C / n) × Af, em que C = 17,7 ng / cm 2, N: Bifónico]. </li><li> Calcula-se a fracção molar de colesterol no SLB, tendo em conta os pesos moleculares de lípido DOPC (786,1 g / mol) e colesterol (386,6 g / mol). </li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

Neste trabalho, um protocolo de solvente de permuta é apresentado na qual lípidos em álcool (isopropanol, etanol, ou n-propanol) são incubadas com um suporte sólido e, em seguida, o álcool é gradualmente substituído com uma solução tampão aquosa, a fim de conduzir uma série de transições de fase, eventualmente, produzir-fase lamelar bicamadas lipídicas 24. Mostra-se que o método permite a fabricação de bicamadas lipídicas apoiadas em superfícies tais como o ouro, que é insolúvel ao método de fusão de vesículas. Um intervalo de concentração de lípidos optimizada (0,1 - 0,5 mg / ml) foi determinada para a completa formação de bicamada, em formatos padrão experimentais testadas até agora. Com concentrações de lípidos abaixo de 0,1 mg / ml, discretas, manchas microscópicas de bicamadas formado. Por outro lado, a concentrações superiores a 0,1 mg / ml e inferior a 0,5 mg / ml, uma bicamada completa e uniforme. Em concentrações de lipídios acima deste intervalo, uma bicamada fluido ainda foi formada como verified por análise de FRAP, no entanto, a microscopia de fluorescência revela a presença de estruturas de lípidos adicionais no topo da camada dupla. Surpreendentemente, a morfologia destas estruturas de lípidos adicionais, tal como determinado por análise QCM-D, dependia do álcool que foi usado durante o passo de incubação. No caso de etanol, os deslocamentos relativamente elevadas de f e Δ D ô assemelhar-se a assinatura QCM-D obtida por uma camada adsorvida vesícula. Quando o isopropanol ou n-propanol em vez foi usado, o Δ f era ligeiramente mais elevado do que o valor esperado para uma bicamada (f Δ final entre -30 a -40 Hz), enquanto a Δ D foi significativamente superior. Tais respostas QCM-D seria esperado para as estruturas lipidicas prolongados (por exemplo, micelas vermiformes) salientes para fora a partir da superfície da membrana (como visível por microscopia de fluorescência, em alguns casos). A taxa de troca de solvente é um outro parâmetro importante que pode ser crítico, especially quando as concentrações de lípidos mais baixas (por exemplo, 0,1 mg / ml) são usadas. Rápida troca de solvente a baixa concentração de lípidos pode levar à formação de bicamadas incompletos. Na câmara de medição padrão usada para medições QCM-D neste papel (Q-Sense E4 câmara de medição), as taxas de fluxo de cerca de 100 mL / min, foram adequados para a formação de bicamada completa altamente reprodutível. Para as células de fluxo com outras geometrias e volume, a taxa de fluxo ideal pode variar e deve ser determinada empiricamente com base nos passos aqui sugeridas. Além de formar bicamadas lipídicas apoiadas em superfícies que são intratáveis ​​a fusão de vesículas, o SALB pode ser utilizado para contornar a necessidade de vesículas lipídicas que podem romper, abrindo assim as portas para a fabricação de membranas suportadas com composições complexas. Como exemplo ilustrativo de uma composição, misturas de lípidos com uma fracção elevada de colesterol foram examinados. O colesterol é um componente importante de mammAliã membranas celulares, e a sua fracção pode aproximar-se de 45-50% em moles de a composição lipídica da membrana (por exemplo, em eritrócitos). Assim, mesmo um modelo simples de uma bicamada lipídica representando uma membrana celular humana deve incluir colesterol. Embora a fusão da vesícula pode ser utilizado para fabricar bicamadas lipídicas fluídicos contendo apenas 10-15% de colesterol, o método permite a formação de SALB bicamadas lipídicas fluídicos fracções contendo altos de colesterol (até 57% em mol, tal como quantificado por medições QCM-D) 36. No entanto, quando o nível do colesterol foi ainda mais elevada (até 63% em mol), domínios em forma de faixa 37 foram observados. Os domínios de co-existentes eram líquidas, reminiscente do que as observadas na região de β no diagrama de fases da monocamada de fosfolípidos de colesterol / na interface ar-água. Em geral, o método de SALB é mostrado ser um método simples e eficiente para formar bicamadas lipídicas suportados, especialmente in casos que ultrapassam o âmbito do método de fusão das vesículas convencionais. Até agora, as técnicas de microscopia de fluorescência e QCM-D foram utilizados principalmente para caracterizar as bicamadas lipídicas formadas suportados pelo método SALB. Olhando para a frente, uma ampla gama de técnicas de medições analíticas sensíveis de superfície, incluindo ressonância de plasma de superfície (SPR) 38, microscopia de força atômica (AFM) 39,40, com transformada de Fourier espectroscopia de infravermelho 41, raio-X 42 e 43 nêutrons refletividade pode, ser utilizado para caracterizar adicionalmente e estudar configurações de bicamada simples e complexos Preparar pelo método SALB. Estas capacidades emergentes abrir a porta a um maior número de cientistas que podem explorar as membranas celulares artificiais, tirando partido de um protocolo experimental simples e robusto.

O sólido suportado bicamada lipídica 1 (SLB) é uma plataforma versátil que preserva as características básicas das biomembranas tais como a espessura da bicamada, difusividade lípido bidimensional, e a capacidade de acolher biomoléculas associadas a membranas. Devido à complexidade das membranas celulares naturais, esta plataforma simples tem sido demonstrado funcionar como uma plataforma eficiente para estudos in vitro de processos relacionados com a membrana, tais como formação de jangada 2, proteína de ligação 3, vírus e ligação partícula semelhante a vírus 4,5 e sinalização de 6 células. Formou-se em estreita proximidade com um suporte sólido, a plataforma SLB é compatível com uma gama de medições de superfície sensível técnicas tais como microscopia de reflexão interna total (TIRF), microbalança de cristal de quartzo de dissipação (QCM-D), e espectroscopia de impedância. Vários métodos têm sido desenvolvidos para produzir diferentes tipos de SLBS bolha de ar, incluindocolapso 7 e dip-pen nanolithography 8 para pontos de lipídios tamanho submicrométricas-, 9 para pilhas bicamada e Langmuir-Blodgett (LB) de 10 e fusão de vesícula (VF) 11 para full-spanning, revestimentos bicamada lipídica individuais de revestimento de spin. O método consiste em FV a adsorção de pequenas vesículas unilamelares a um suporte sólido e subsequente ruptura espontânea e fusão para formar uma bicamada lipídica contínua. No entanto, sob condições fisiológicas, rotura espontânea de vesículas é principalmente limitada a materiais à base de silício, tais como o dióxido de silício, vidro, e mica. Além disso, a ruptura de vesículas não ocorre espontaneamente em vesículas de composições de lípidos complexos, tais como aqueles contendo elevadas fracções de colesterol ou lípidos carregados negativamente. Dependendo do sistema, a ruptura da vesícula pode ser induzida através da adaptação ainda mais as condições experimentais, tais como a temperatura de 12, o pH da solução de 13, 14 e salinidade, choque osmótico 15 </saté&gt; 16 ou a pressão, ou a adição de iões divalentes, tais como Ca 2+ 17. Alternativamente, o péptido HA-activo da membrana pode ser introduzido, de modo a desestabilizar uma camada de vesículas adsorvidas, levando a ruptura das vesículas e formação de bicamada numa gama de superfícies 18-22. Além disso, a formação de bicamada bem sucedida requer uma preparação de uma população bem controlada de pequenas vesículas unilamelares, que pode ser demorado e difícil de conseguir para certas composições de membrana. Portanto, apesar da sua elevada eficiência, em casos ideais (por exemplo, depois de extensa pré-tratamento de congelamento-descongelamento de vesículas 23), a aplicação geral de fusão das vesículas está limitado pelo âmbito de substratos adequados e composições de membrana. O método assistido por solvente 24-28 bicamada lipídica (SALB) é uma técnica de fabricação alternativo que não requer vesículas lipídicas. O método baseia-se na deposição óf moléculas lipídicas sobre uma superfície sólida, na presença de um solvente orgânico miscível com água, seguido por troca gradual de este solvente com uma solução tampão aquosa, a fim de provocar a formação de SLB. Durante o passo de permuta de solvente, a mistura ternária de lípidos, solvente orgânico, e a água passa por uma série de transições de fase com o aumento da fracção de água, o que leva à formação de estruturas de fase lamelar em solução em massa e um SLB no substrato sólido. Importante, este trajecto de auto-montagem evita a necessidade de ruptura de vesículas, que geralmente é o passo limitante para a transformação de vesículas adsorvidos num SLB. O protocolo é aplicável a uma ampla variedade de superfícies, incluindo o dióxido de silício, óxido de alumínio, de cromo, óxido de índio e estanho e ouro. Neste papel e no vídeo acompanhante, uma comparação de deposição de lípidos pela SALB e métodos de fusão de vesículas é apresentado. Em particular, a influência dos parâmetros experimentais, incluindo a concentração de lípido, A taxa de fluxo, e a escolha de água solvente orgânico miscível, sobre a qualidade da bicamada formado pelo método SALB são discutidos. A caracterização analítica dos SLBS fabricados é realizada pela QCM-D, microscopia de fluorescência, e recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) técnicas. Monitorização QCM-D é uma técnica de medição de massa sensíveis à superfície que, uma vez que o trabalho pioneiro conduzido por Keller e Kasemo 29, tem sido amplamente utilizada para investigar quantitativamente formação em bicamada. A microscopia de fluorescência permite a inspecção de homogeneidade da membrana, bem como a visualização de domínios de membrana. A técnica FRAP é uma ferramenta padrão para determinar a mobilidade lateral das moléculas de lípidos em uma SLB, que é uma propriedade essencial das membranas fluídicos. A primeira parte deste estudo envolve a análise QCM-D do SALB e métodos de fusão de vesículas aplicada para tentar a formação de bicamada em dióxido de silício e ouro. Na segunda parte,a preparação e caracterização das membranas de suporte contendo uma gama de concentrações de colesterol com o método SALB são demonstradas e os resultados são comparados com os obtidos pelo método de fusão das vesículas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1459">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">QCM-D silicon dioxide-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QCM-D gold-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Sense E4 module</td>
			<td>QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plasma Cleaner, PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-001 (115V)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:217px;">700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:217px;">C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">673773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Ethanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">n-propanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">279544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sticky-Slide I 0.1 Luer</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">81128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Male elbow 1/8&#8221;</td>
			<td style="width:356px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:217px;">30505-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Silicon tubing 1.6mm ID</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:356px;">Ismatec</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">71725</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method

A fim de imitar as membranas celulares, a bicamada lipídica suportado (SLB) é uma plataforma que permite atraente na investigação de processos in vitro relacionadas com a membrana, enquanto que confere biocompatibilidade e biofuncionalidade a substratos sólidos. A adsorção e ruptura espontânea de vesículas fosfolipídicas é o método mais comummente utilizado para formar SLBS. No entanto, sob condições fisiológicas, a fusão das vesículas (VF) é limitado a apenas um subconjunto das composições de lipidos e suportes sólidos. Aqui, nós descrevemos um procedimento geral de um chamado passo do método de formação assistida por solvente bicamada lipídica (SALB), a fim de formar SLBS que não necessita de vesículas. O método envolve SALB a deposição de moléculas de lípidos sobre uma superfície sólida, na presença de solventes orgânicos miscíveis em água (por exemplo, isopropanol) e subsequente troca de solvente com uma solução aquosa de tampão, a fim de provocar a formação de SLB. O passo de troca de solvente contínua permite a aplicação dométodo em uma configuração de fluxo adequado para a formação de bicamada monitorização e alterações subsequentes que utilizam uma vasta gama de biossensores sensíveis à superfície. O método SALB pode ser usado para fabricar SLBS sobre uma vasta gama de superfícies sólidas hidrofílicos, incluindo aqueles que são intratáveis ​​a fusão das vesículas. Além disso, permite a fabricação de compostos SLBS de composições de lípidos que não pode ser preparado utilizando o método de fusão das vesículas. Nisto, nós comparar os resultados obtidos com os métodos de fusão de vesícula SALB e convencionais em duas superfícies hidrofílicas ilustrativos, dióxido de silício e ouro. Para optimizar as condições experimentais para a preparação das bicamadas de alta qualidade preparados através do método de SALB, o efeito de vários parâmetros, incluindo o tipo de solvente orgânico no passo de deposição, a taxa de permuta de solvente, e a concentração de lípido é discutido juntamente com dicas de resolução de problemas . Formação de membranas apoiadas contendo altas frações de colesterol é também demôniostrados com o método SALB, destacando as capacidades técnicas da técnica SALB para uma ampla gama de configurações de membrana.

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Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Apresenta-se um protocolo experimental para formar uma bicamada lipídica suportado sobre substratos sem a utilização de vesículas lipídicas. Nós demonstramos um método de um só passo para formar uma bicamada lipídica em dióxido de silício e ouro, bem como membranas suportadas com o domínio enriquecida em colesterol durante várias aplicações biológicas.

Biomembrane Fabrication pelo Solvent-assistida Lipid bicamada (SALB) Método

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

biomembrane-fabrication-solvent-assisted-lipid-bilayer-salb

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

14.6K visualizações.  Nanyang Technological University.  Apresenta-se um protocolo experimental para formar uma bicamada lipídica suportado sobre substratos sem a utilização de vesículas lipídicas. Nós demonstramos um método de um só passo para formar uma bicamada lipídica em dióxido de silício e ouro, bem como membranas suportadas com o domínio enriquecida em colesterol durante várias aplicações biológicas. 

Vídeo: Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

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An integrated microfluidic thermoplastic chip has been developed for use as a molecular diagnostic. The chip performs nucleic acid extraction, reverse transcriptase, and PCR. Methods for fabricating and running the chip are described.

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Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Formação de biomembrana Microarrays com um método de montagem baseada em Rodo

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Lipid Bilayer Vesicle Geração Usando Microfluidic jateamento

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polimérico Fabrication matriz Microneedle por fotolitografia

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) para intracelular Segmentação Aplicações

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

Formação Automated Lipid bicamada da membrana Usando um polidimetilsiloxano Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Matrizes ligando Nano-fragmentação em uma bicamada lipídica Compatível

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices cannot be worn under everyday conditions. Therefore, textiles are commonly considered the best substrate to accommodate electronic devices in wearable use. In this paper, we describe how to selectively pattern organic electroactive materials on textiles from a solution in an easy and scalable manner. This versatile deposition technique enables the fabrication of wearable organic electronic devices on clothes.

In this paper, we present a protocol to selectively deposit organic materials on textiles, which allows for the direct integration of organic electronic devices with wearables. The fabricated devices can be fully integrated in textiles, respecting their mechanical appearance and enabling sensing capabilities.

Um método de fabricação simples e escalável para dispositivos eletrônicos orgânicos sobre os têxteis

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage research has focused on the development of regenerative scaffolds. This article describes the development of scaffolds that are completely derived from natural cartilage extracellular matrix, coming from an equine donor. Potential applications of the scaffolds include producing allografts for cartilage repair, serving as a scaffold for osteochondral tissue engineering, and providing in vitro models to study tissue formation. By decellularizing the tissue, the donor cells are removed, but many of the natural bioactive cues are thought to be retained. The main advantage of using such a natural scaffold in comparison to a synthetically produced scaffold is that no further functionalization of polymers is required to drive osteochondral tissue regeneration. The cartilage-derived matrix scaffolds can be used for bone and cartilage tissue regeneration in both in vivo and in vitro settings.

Decellularized cartilage-derived scaffolds can be used as a scaffold to guide cartilage repair and as a means to regenerate osteochondral tissue. This paper describes the decellularization process in detail and provides suggestions to use these scaffolds in in vitro settings.

Fabricação de matriz de cartilagem-derivado Decellularized andaimes

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...