Agradecemos a um fundo interno da Universidade de Oklahoma (para BZ) e uma bolsa da NSF (IOS-1025556, para BZ e RAB) para apoiar TRF, RAB, XP, AAO, MLW, CAS, e esta pesquisa. Uma subvenção de NIH (NS060878 RO1, para BZ) parcialmente financiado RAB. RAB reconhece um NRSA NIH (T32 NS07292) treinamento subvenção concedida a Brandeis University, e uma subvenção de NIH (RO1 GM21473) concedido a Jeffrey Hall, Brandeis, para apoiar as fases iniciais deste estudo. Agradecemos a Jeffrey Hall para seus encorajamentos contínua para este projeto. Agradecemos ao Dr. Kristin Scott por nos fornecer a banheira P&gt; Gal80 tensão&gt;.

1. Drosophila cepas <ol><li> Gal4 driver: GMR-Gal4, que expressa Gal4 em células fotorreceptoras. </li><li> UAS linhas UAS-MJD78Q (ou UAS-polyQ), que causa degeneração neural em Gal4 células que expressam. UAS-GFP, que expressa GFP em Gal4 células que expressam. </li><li> Linhas de FLP ey-FLP, que expressa FLP em fotorreceptores e em subconjuntos de regiões do cérebro. ET-FLPx2 linhas, que são enhancer trap-linhas contendo duas cópias da FLP (FLP-IRES-FLP). Temos gerado ~ 1000 ET-FLP linhas (Bohm et al., 2010), cuja expressão padrões ainda estão para ser caracterizado. Aqui, descrevemos a caracterização do padrão de expressão de ET-selecionar FLPx2 na larva e adulto voar sistema nervoso central (SNC). </li><li> Repórter FLP yw, actina P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP (Pignoni &amp; Zipursky, 1997), que relata o padrão de expressão de ET-FLPx2 através de actina P&gt; Gal4; UAS-GFP sobre FLP mediada por excisão de recombinational&gt; CD2. </li><li> Dois complementares Gal80 conversora de ferramentas Banheira P&gt; Gal80&gt; (Gordon &amp; Scott, 2009), a construção de flip-out, que constitutivamente expressa Gal80 em todos os tecidos dirigido por um promotor de tubulina forte. Após a FLP mediada recombinação,&gt; Gal80 está virado para fora e Gal80 expressão é terminada apenas em ET-FLPx2 expressando tecidos. Banheira P&gt; parar&gt; Gal80 (Bohm et al., 2010), o flip-em construção, que não expressa Gal80 em condições normais. Gal80 expressão é ativada pelo promotor tubulina apenas em ET-FLPx2 expressar-tecidos em que FLP enlouquece parar&gt; e vira em Gal80. </li><li> Moscas para testar a atividade FLP no olho composto GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira P&gt; parar&gt; Gal80 (Bohm et al, 2010.), Que degeneram e os olhos despigmentados. Em FLP-expressando células fotorreceptoras, expressão polyQ é desligado após Gal80 flip-in. GMR-Gal4, UAS-polyQ; (. Bohm et al, 2010) tub P&gt; Gal80&gt;, que tem olhos normais. Em FLP-expressando células fotorreceptoras, expressão polyQ está ligado seguintes Gal80 flip-out. </li></ol> 2. Reagentes Tampão fosfato (PBS, 1X), pH 7.4. Paraformaldeído a 4% (PFA), diluído em PBS de 16% PFA, EM grau (Cat # 15710, Ciências Microscopia Eletrônica, Hatfield, PA) PBT, 1XPBS contendo 0,1% Triton-X 100 (Sigma) Anti-Elav (mAb, 9F8A9; Developmental Estudos Hibridoma Bank, da Universidade de Iowa), manchas todos os neurônios em Drosophila. Anti-Repo (mAb 8D12; Developmental Estudos Hibridoma Bank, University of Iowa) manchas células gliais em Drosophila. Alexa frango 594 contra anticorpo secundário do mouse (Invitrogen) 3. Mapeamento do padrão de expressão de linhas enhancer-trap FLPx2 (* passos críticos) <ol><li> Coletar fêmeas virgens do yw, actina P&gt; CD2&gt; Gal4; linha UAS-GFP e cruzar com os homens de cada ET-FLPx2 linhas. O primeiro serve como um repórter GFP para a expressão tecido de ET-FLP. </li><li> * Dissecar vagando 3 º instar as larvas F1, manter o sistema nervoso central (isto é, o cérebro eo cordão nervoso ventral, VNC) e da parede do corpo, correção para uma hora em PFA 4% sobre o gelo, lave 3X com PBS gelado seguido por lava 3X com PBT. Dissecação <ol><li> Remover vagando 3 º instar as larvas F1 e coloque-os em um prato limpo Sylgard (35 mm x 10 mm placa de petri preenchida com 2 gramas de Sylgard - misturado de acordo para a fabricação de instruções). <ol><li> Remover restos de comida com pincel </li></ol></li><li> Encha o prato com gelado 1XPBS e colocar no gelo para anestesiar as larvas </li><li> Segure os ganchos na boca de uma larva com uma pinça e pegar a cutícula perto do espiráculo estendendo anterior com outro par de fórceps e descascar a cutícula para o fim posterior. O SNC será anexado a ganchos na boca, juntamente com as glândulas salivares, intestino e discos imaginais. </li><li> Retire o excesso de tecido e discos imaginal em torno do CNS. </li><li> Transferência do SNC em um PBS-cheia 3 pirex bem. <ol><li> A siliconada P200 ponteira pode ser usada para evitar a secagem do tecido. </li></ol></li><li> Correção para uma hora em 200 mL de PFA 4% sobre o gelo. <ol><li> Garantir que o CNS é completamente submersas na PFA. <ol><li> Se o SNC flutua, isso normalmente sugere que o CNS não é devidamente limpo a partir do tecido circundante. </li></ol></li></ol></li><li> Lavar 3X com PBS gelado seguido por lavagens 3X com PBT. </li></ol></li><li> * Dissecar o SNC de moscas F1 adulto. <ol><li> Anestesiar as moscas com CO 2 ou colocar as moscas contido dentro de um frasco vazio no gelo por 10 minutos. </li><li> Adulto lugar voa em um prato de vidro de 95% EtOH repletas de gelo por 30 seg. </li><li> Transferência de moscas em um prato de vidro cheio 1XPBS no gelo. <ol><li> Lavar 3X com gelado 1X PBS para remover EtOH residual </li></ol></li><li> Coloque uma mosca em uma Sylga 35 milímetrosrd prato cheio de PBS 1X gelada </li><li> Coloque o lado ventral para cima e coloque uma caneta pequeno inseto (pinos minutiens 0,1 mm) no meio do abdômen. <ol><li> Usando um par de fórceps segure a base das pernas e retire as pernas com um par de fórceps. </li></ol></li><li> Remover a cutícula cabeça <ol><li> Enquanto agarrando a tromba com um par de fórceps, coloque outra por baixo do olho e descascar a cutícula para a linha dorsal da cabeça voar. </li><li> Agarre o outro olho e remover a cutícula restantes do outro lado. </li><li> Utilizando uma pinça afiada e / ou agulha de tungstênio afiada, remover o tecido traqueal que envolvem o cérebro <ol><li> Limpeza inadequada da traquéia vai resultar em forte auto-fluorescência, obstruindo expressão GFP, e permitir que o cérebro a flutuar durante a fixação </li></ol></li></ol></li><li> Dissecação VNC <ol><li> Remover a cutícula torácica <ol><li> A partir do final posterior do tórax, coloque duas pinças em cada lado do preepisternum 3 º (isto é, agarrando a base das pernas). </li><li> Separar delicadamente a cutícula longe da linha média ventral, repita isso até chegar na base do pescoço. </li><li> Puxe as duas metades da cutícula torácica expondo o VNC </li></ol></li><li> Em seguida remova o abdômen do tórax. Enquanto estiver usando uma pinça para segurar o tórax, na base da segunda mão, use um outro par de pinças para agarrar o abdômen perto do primeiro esternito abdominal e puxe o abdômen fora. </li><li> Para remover o VNC do tecido circundante torácica. Manter a área umeral com um par de fórceps e com outro par de fórceps lágrima suave longe da maioria da carcaça torácica. </li><li> Neste ponto, deve haver um anel de tecido conjuntivo em torno do conjuntivo cervical (pescoço). Utilizando duas pinças de rasgar o anel de distância. </li><li> Remova qualquer excesso de tecido torácica em torno do VNC </li></ol></li><li> Transferência do cérebro e da VNC a 9 bem-pirex contendo 1X PBS sobre o gelo <ol><li> A siliconada P200 ponteira pode ser usada para evitar a secagem do tecido </li></ol></li></ol></li><li> * Fix do SNC adulto por 1 hora em PFA 4% sobre o gelo e lave 3X com PBS gelado e 3X com PBT. </li><li> Incubar a preparação do SNC adulto ou do SNC larval e parede do corpo a 4 ° C durante a noite com anticorpos para ambos os neurônios (anti-Elav, 1:10) ou glia (anti-Repo. 1:10). Lave a preparação de 5X com PBT. </li><li> Incube com a preparação de adultos ou larvas com Alexa frango 594 contra rato anticorpo secundário (1:100) em temperatura ambiente durante 2 horas, e lavar a preparação com PBS. </li><li> Monte o CNS larval ou adultos em um slide. Para preservar a forma natural do SNC, use um anel de plástico em forma de O (Label claro reforço, Avery Dennison, Produtos Office, Brea, CA) no slide como um mini-ponte para suspender a lamínula. </li><li> Examinar a preparação para os padrões de boas práticas agrícolas e Elav (ou Repo) expressão sob um microscópio fluorescente. </li></ol> 4. A aplicação de dois complementares Gal80 conversora de ferramentas na repressão Gal4 em fotorreceptores <ol><li> Gal80 lançando para fora através de banheira P&gt; Gal80&gt; (Figura 5A). <ol><li> Coletar os machos da GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira P&gt; Gal80 line&gt;. Note-se que os olhos compostos são normais nestas moscas. </li><li> Acasalar com ey FLP-virgens. </li><li> Coletar as moscas F1 e examinar o fenótipo dos olhos. </li></ol></li><li> Flipping Gal80 em via banheira P&gt; parar&gt; Gal80 (Figura 5B). <ol><li> Coletar GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira P&gt; parar&gt; Gal80 machos e examinar o fenótipo dos olhos. Observe a degenerar e olhos despigmentados nestas moscas em comparação com cepas do tipo selvagem (Canton-S) </li><li> Acasalar com ey FLP-virgens; </li><li> Coletar as moscas F1 e examinar o fenótipo dos olhos. </li></ol></li><li> Selecione ET-FLPx2 linhas com expressão em células fotorreceptoras </li></ol> Passos 4.1 e 4.2 pode ser repetido usando ET-FLPx2 linhas que expressam FLP em um subconjunto de células fotorreceptoras. Em alternativa, seja a GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira P&gt; parar&gt; Gal80 moscas ou a GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira P&gt; Gal80&gt; moscas podem ser cruzados para indivíduo ET-FLPx2 linhas para triagem de linhas que expressam FLP em células fotorreceptoras. Valiosa ET-FLPx2 linhas são aqueles que só FLP expressa em um subconjunto ou células fotorreceptoras único (Figura 6). 5. Resultados representativos O padrão de expressão de uma linha de ET-FLPx2 específico pode ser facilmente analisado e documentado na F1 larvas ou adultos moscas derivada do cruzamento entre yw, actina P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP virgens e ET-FLPx2 do sexo masculino (Figura 1) . Normalmente, três a cinco repetições dos animais F1 são dissecados e examinados para determinar a reprodutibilidade do padrão de expressão FLP (Bohm et al., 2010). <strong&gt; A Figura 2 mostra o padrão de expressão de FLP em ET-173A FLPx2 line no SNC larval e adulto. O padrão de FLP pode ser ainda analisados ​​usando um marcador neuronal ou glial (Figura 3 e 4). Os resultados mostrados na Figura 7 ilustram a eficácia da Gal80 flip-e flip-out sistemas na repressão interseccional de Gal4 recombinação FLP mediada seguinte. A banheira P&gt; parar&gt; Gal80 construção não parece ter qualquer expressão de leaky Gal80 (baseado na degeneração uniforme e despigmentação de fotorreceptores), e ainda é 100% eficaz em lançar Gal80 com a ajuda de eyFLP para reprimir GMR- Gal4 e restaurar o olho às aparências normal (Fig. 7A). Pelo contrário, banheira P&gt; Gal80&gt; totalmente reprime GMR-Gal4 antes da introdução de eyFLP. Seguintes Gal80 flip-out, GMR-Gal4 drives expressão UAS-polyQ, levando à degeneração e olhos despigmentados (Fig. 7B). Neste exemplo, usamos um FLP photorecetor pan-mapear &quot;circuitos&quot; do fotoreceptor, mas não examinar as conseqüências comportamentais. Usando abordagens semelhantes com comportamentalmente relevantes Gal4 linhas, mapeamos parte do circuito-Gal4 CCAP regulam expansão asa nas moscas adultas (Bohm et al., 2010). Acreditamos que o método FINGR será valioso em ajudar a nossa compreensão da base neuronal de comportamento. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. . Examinar o padrão de expressão de uma linha de ET-FLPx2 O padrão de expressão FLP (ovais azuis) de uma linha de ET-FLPx2 pode ser determinada pela passagem de uma ET-FLPx2 do sexo masculino (superior esquerdo) com um actina P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS- GFP virgem (canto superior direito). Onipresente Actina P&gt; expressão Gal4 na fêmea parental é prejudicada pela inserção do (triângulos cinza) FRT seqüência CD2 flanqueado. Na progênie F1, FLP será imposto a seqüência CD2, permitindo Actina P&gt; Gal4 dirigir UAS-GFP expressão. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Padrão de expressão de uma linha de ET-FLPx2 na larvas e adultos do sistema nervoso central. Estas imagens retratam o SNC (cérebro e medula nervosa ventral, VNC) dissecada da prole produzida a partir de acasalamento yw, actina P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP pais para o ET-FLPx2 173A linha. Ao recombinar a&gt; CD2 cassete&gt;, FLP ativa actina expressão P&gt; GAL4 (a expressão conseqüente da UAS-GFP). Assim, o padrão de GFP relatórios FLP células que expressam. Um painel mostra o padrão de expressão larval FLP enquanto painel B mostra o padrão de expressão de adultos em linha 173A. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Caracterização de tipos de células que expressam flippase em ET-FLPx2 Line # 688A. A, A imagem composta de uma fixa de 3 ª F1 larva instar corados com anti-REPO de um cruzamento entre ET-FLPx2 linha # 688A e uma linha hierárquica Flippase GFP. BD, A alta ampliação view (Zeiss Plano Apochromat-63x de petróleo) retirados da extremidade posterior de um VNC a partir de uma 3 ª larvas. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Caracterização de tipos de células dentro do corpo cogumelo de ET-FLPx2 Line # 150. AC, Uma imagem de alta ampliação (63x imersão em óleo) do corpo de um cogumelo 3 F1 fixo larva instar corados com anti-REPO. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Ilustração de Gal80 Estratégias Flip-no e Flip-out. A. Na estratégia de flip-out, tubulina promotor-driven Gal80 (Tub P&gt; Gal80&gt;) é constitutivamente ativo, resultando na repressão da GMR-Gal4 e um fenótipo do tipo selvagem olhos (olho vermelho). Esta repressão é removida pela introdução de FLP (púrpura), que vai virar Gal80 out (do meio, vermelho) e permitir GMR-Gal4 dirigir-UAS polyQ expressão. Isso resulta em degeneração das células fotorreceptoras (ilustrado por pontos brancos no olho). B. No inverso da estratégia anterior, tubulina promotor-driven Gal80 expressão é interrompido por FRT (cinza triângulo) ladeado codon &quot;stop&quot;. Na ausência de Gal80, GMR-Gal4 liga-se a UAS-polyQ causando degeneração neuronal em fotorreceptores (ilustrado por pontos brancos no olho). Ao cruzar a GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira P&gt; parar&gt; GAL80 machos com fêmeas virgens, que expressam FLP nas células fotorreceptoras, FLP (púrpura) vai catalisar a recombinação nos locais FRT, excisão do &quot;stop&quot; códon (médio, vermelho), permitindo assim Gal80 expressão e repressão da GMR-Gal4. Este reserva-se o neurodegeneração em células fotorreceptoras (ilustrado pela falta de white pontos no olho). <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. A aplicação do método FINGR em lançar Gal80 por meio ET-FLPx2 Line # 688A progênie F1 de um cruzamento entre ET-FLPx2 linha # virgem 688A a GMR-Gal4, UAS-polyQ;. TubP&gt; GAL80 masculino. A falta de pigmento no meio do olho representa omatídeos expressão FLP em linha # 688A. Nesta área Gal80 supressão da GMR-Gal4 ficou aliviada permitindo que o Gal4 dirigir-UAS polyQ. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Figura 7. A aplicação do método FINGR em lançar Gal80 dentro ou para fora para cruzar Gal4 em fotorreceptores. A. A banheira P&gt; parar&gt; Gal80 sistema de flip-nos restringe GAL4 expressão de uma forma FLP-dependente. Em GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira P&gt; parar&gt; GAL80 moscas, células fotorreceptoras são degenerados e despigmentadas (fly esquerda). Após a introdução da eyFLP, Gal80 é expressa em células fotorreceptoras, resultando em repressão cheio de GMR-Gal4, que por sua vez desliga o polyQ expressão e produz moscas com olhos normais (voar para a direita). B. A banheira P&gt; Gal80&gt; Flip -out sistema funciona de maneira oposta como a banheira P&gt; parar&gt; Gal80 flip-no sistema. Banheira P&gt; Gal80&gt; constitutivamente reprime GAL4 e suprime a expressão de polyQ (esquerda voar, com os olhos normal). Após a introdução da eyFLP, Gal80 está virado para fora a partir de células fotorreceptoras, aliviando a supressão da GMR-Gal4 e ligar o polyQ expressão. Isto leva a degenerar e voa com os olhos despigmentados (voar para a direita).

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	<li>Bohm, R. A., Welch, W. P., Goodnight, L. K., Cox, L. W., Henry, L. G., Gunter, T. C., Bao, H., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+mosaic+approach+for+neural+circuit+mapping+in+Drosophila.">A genetic mosaic approach for neural circuit mapping in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 16378-16383 (2010).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Bruno, B., Holbro, N., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+group+genes+are+required+for+neural+stem+cell+survival+in+postembryonic+neurogenesis+of+Drosophila.">Polycomb group genes are required for neural stem cell survival in postembryonic neurogenesis of Drosophila.</a> Development. 134, 1091-1099 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. , 34-341 (2002).</li><li>Gordon, M. D., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit.">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+rescue+of+memory+dysfunction+in+Drosophila.">Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila.</a> Science. 302, 1765-1768 (2003).</li><li>Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+tissue+specific+transgene+expression+system+using+inducible+GAL4.">A conditional tissue specific transgene expression system using inducible GAL4.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).</li><li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Drosophila+eye+development+by+decapentaplegic.">Induction of Drosophila eye development by decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li><li>Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P[Switch],+a+system+for+spatial+and+temporal+control+of+gene+expression+in+Drosophila+melanogaster.">P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 12602-12607 (2001).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O sistema Gal4/UAS tem sido amplamente utilizada com sucesso por Drosophilists para vários estudos biológicos (Brand &amp; Perrimon, 1993; Duffy, 2002). Até à data, a comunidade mosca tem gerado milhares de promotor-driven e enhancer-trap Gal4 linhas. Uma das principais contribuições do método FINGR é que ele é compatível com o sistema Gal4/UAS, tornando possível expandir significativamente o poder de Gal4 em Drosophila estudos. Uma aplicação importante do método é FINGR circuitos neurais subjacentes afinar comportamento através Gal4/Gal80 cruzamento. Esses comportamentos podem incluir, mas não estão limitados a, aprendizado e memória, namoro, sono e ritmo circadiano. O método FINGR também pode ser usado para mapear os neurônios críticos que são propensas a neurodegeneração na modelagem humana doenças neurodegenerativas, como Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica (ALS), e doenças de Parkinson. Da mesma forma, focos de neurônios ou circuitos neurais crucial para mediar a cocaína, álcool e dependência de outra substância poderia ser mapeados usando o método FINGR. Note-se que Gal4s condicional (Osterwalder et al, 2001;.. Roman et al, 2001) poderia ser usado com o método FINGR, a fim de obter o controle temporal de circuitos neurais e comportamentos. Modificação do Gal80 conversora de ferramentas usando uma Gal80 sensíveis à temperatura (ts Gal80, McGuire et al., 2003) pode produzir banheira P&gt; parar&gt; Gal80 ts ou banheira P&gt; Gal80 ts&gt;, acrescentando ainda mais flexibilidade temporal na manipulação de circuito. Além do sistema nervoso, o método FINGR é igualmente aplicável a restrição Gal4 expressão em subconjuntos de células se é a asa ou a perna. As linhas de ET-FLPx2 será um recurso valioso para todos os biólogos interessados ​​em Drosophila FRT / FLP análise baseada clonal (Xu &amp; Rubin, 1993), incluindo MARCM (Lee &amp; Luo, 1999). Espera-se também que algumas linhas de ET-FLPx2 pode substituir heatshock FLP-para a produção de clones reprodutível e de repetidas análises morfológicas e comportamentais. Como linhas Gal4 enhancer-armadilha, a maioria dos ET-FLPx2 linhas não são susceptíveis de ser expresso especificamente nas células do seu interesse. A maioria das linhas vai expressar FLP nas células de interesse e em outras células ou tecidos também. No entanto, a falta de &quot;especificidade do tecido de ambas as Gal4 e ET-FLPx2 não vai ser uma grande preocupação para o método FINGR enquanto a sua região de sobreposição é desejável para uma experiência particular. FINGR é projetado para ligar dois &#39;grandes&#39; sistemas em um refinado. Os métodos ilustrados nestes protocolos são bastante padrão e deve ser reprodutível. Os principais passos de advertência que exigem atenção de alguém são a seleção e uso do fixador. Fixadores que não PFA devem ser evitados, porque eles vão saciar sinal de boas práticas agrícolas. Temos também observou que o prato dissecção não deve ser usado para fixação com PFA para evitar a possibilidade de que a expressão FLP não será confiável relatado por GFP.

mapping and application of enhancer-trap flippase expression in larval and adult drosophila cns

O método binário Gal4 / UAS é poderoso para o gene e manipulação de circuitos neurais em Drosophila. Para a maioria dos estudos neurobiológicos, no entanto, raramente é Gal4 expressão tecido-específica o suficiente para permitir a correlação precisa do circuito com leituras comportamentais. Para superar este obstáculo, que recentemente desenvolveu o método FINGR para alcançar um mais restritivo Gal4 expressão no tecido de interesse. O método FINGR tem três componentes: 1) o sistema Gal4/UAS tradicionais; 2) um conjunto de FLP / FRT mediada Gal80 ferramentas de conversão, e 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 é usado para definir o circuito primário neural de interesse. Comparação do Gal4 com um UAS-efetoras, tais como UAS-MJD78Q ou UAS-Shi ts, regula a atividade neuronal, que por sua vez é manifestada por alterações no comportamento da mosca. Com um adicional de UAS-repórter, como UAS-GFP, o circuito neural envolvido no comportamento específico pode ser mapeada simultaneamente para análise morfológica. Para Gal4 linhas com a expressão ampla, Gal4 expressão pode ser restringida por meio de dois complementares Gal80 conversora de ferramentas: banheira P&gt; Gal80&gt; (&quot;flip out&quot;) e banheira P&gt; parar&gt; Gal80 (&#39;flip em&#39;). Finalmente, os investigadores podem transformar Gal80 ligado ou desligado, respectivamente, com a ajuda de tecidos específicos ET-FLP. No flip-in modo, Gal80 vai reprimir Gal4 expressão onde Gal4 e ET-FLP se cruzam. No modo de flip-out, Gal80 irá aliviar Gal4 repressão nas células em que se sobrepõem Gal4 e FLP. Ambas as abordagens permitem à restrição do número de células no circuito Gal4-definido, mas em um padrão inverso. O método FINGR é compatível com a vasta coleção de Gal4 linhas na comunidade voar e altamente versátil para a análise clonal tradicionais e para o mapeamento do circuito neural. Neste protocolo, demonstramos o mapeamento dos padrões de expressão FLP em selecionar ET-FLPx2 linhas ea eficácia do método FINGR em células fotorreceptoras. O princípio do método FINGR também deve ser aplicável a outros organismos modelo genético em que Gal4/UAS, Gal80 e FLP / FRT são usados.

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Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Nós descrevemos um Flippase induzida interseccional Gal80/Gal4 repressão método (FINGR), permitindo que o tecido específico FLP para determinar Gal80 padrões de expressão. Onde quer que Gal4 e sobreposição FLP, Gal4 expressão é ligado (Gal80 virado para fora) ou desligado (Gal80 capotou in). O método FINGR é versátil para análise clonal e mapeamento do circuito neural.

Mapeamento e Aplicação de Enhancer-trap Expressão Flippase em larval e Adultos Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

16.4K visualizações.  University of Oklahoma - Norman. Nós descrevemos um Flippase induzida interseccional Gal80/Gal4 repressão método (FINGR), permitindo que o tecido específico FLP para determinar Gal80 padrões de expressão. Onde quer que Gal4 e sobreposição FLP, Gal4 expressão é ligado (Gal80 virado para fora) ou desligado (Gal80 capotou in). O método FINGR é versátil para análise clonal e mapeamento do circuito neural.

Vídeo: Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualização de Larval Nervos segmentar em 3 Rd Instar Drosophila Preparações larval

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Neurociência

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Segmentação Olfactory Neurônios Bulb Usando Combinado In Vivo Eletroporação e Gal4-Based Enhancer Lines Armadilha Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissecção e imunohistoquímica de larvas, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila Adulto Olfativo Choque Aprendizagem

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Imagem Funcional do Cortex Auditivo em gatos adultos usando de alta campo fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

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The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

Aquisição de Vídeo de Alta Qualidade Digital de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvais e adultas Comportamentos de uma perspectiva lateral

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Usando Canais Linear de agarose para o Estudo<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamento larval Crawling

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...