Este protocolo permite a análise da estrutura tridimensional de humanos muito grandes na microscopia de balé de tecido adiposo do rato. Facilitando a ligação da disfunção patológica com alterações estruturais teciduais adiposos. Este processo de compensação é muito simples, muito bem adaptado para limpar humanos em camundongos quentes e usar menos solvente tóxico, como etanol ou salicilato de metila em comparação com outros protocolos claros.
Comece imergindo o rato colhido ou tecido adiposo branco humano em pelo menos 10 mililitros de formaldeído de 4% de potência em PBS em um tubo plástico de 15 mililitros preferencialmente sob uma capa química. Agite o tecido em uma placa de rolamento à temperatura ambiente por uma hora antes de transferir o tubo para uma placa de rolamento a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, enxágue o tecido adiposo branco fixo em 10 mililitros de PBS por cinco minutos à temperatura ambiente para remover todos os traços de fixação e transferir o tecido para um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de 0,3% de glycina na PBS para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente em um agitador orbital a 100 rotações por minuto.
Quando os restantes grupos de aldeídos livres tiverem sido extintos, mergulhe o tecido em um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de 0,2% Triton X-100 em PBS para uma incubação de duas horas com agitação a 37 graus Celsius. No final da incubação, trate o tecido com 10 mililitros de 0,2% Triton X-100 e 20% DMSO com agitação a 37 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de 0,1%Tween 20, 0,1%Triton X-100, 0,1% desoxicolato e 20% DMSO em PBS para uma incubação de pelo menos 24 horas a 37 graus Celsius com agitação.
No final da incubação, enxágue o tecido com 10 mililitros de 0,2% Triton X-100 em PBS em um agitador orbital a 100 revoluções por minuto durante uma hora. Seguido pela imersão em 15 mililitros de 0,2%Triton X-100, 10% DMSO e 3%BSA na PBS por 12 horas a 37 graus Celsius com agitação. Para coloração do tecido adiposo branco.
Transfira o tecido para 300 microliters de 0,2%Triton X-100, 10% DMSO e 3%BSA em PBS, complementado com os anticorpos primários de interesse em um micro tubo de 1,5 mililitro, proteja-o da luz com papel alumínio e coloque o tubo em um tubo Falcon de 50 mililitros. Coloque o tubo no agitador orbital para uma incubação de dois dias a 37 graus Celsius com agitação. No final da incubação enxágue o tecido duas vezes em 10 mililitros de 0,2%Triton X-100, 10%DMSO e 3%BSA na PBS por cinco horas a 37 graus Celsius com agitação e proteção contra luz.
Após a segunda lavagem lave o tecido em 10 mililitros de 0,2%Triton X-100 fresco, 10% DMSO e 3%BSA e PBS por 16 a 48 horas a 37 graus Celsius com agitação, em seguida, transfira o tecido para um tubo de 1,5 mililitro contendo 300 microliters de 0,2%Triton X-100, 10% DMSO e 3%BSA em PBS, complementado com os anticorpos secundários apropriados e proteger o tubo da luz usando papel alumínio. Depois de dois dias de incubação a 37 graus Celsius em um shaker, lave o tecido duas vezes em 10 mililitros de 0,2%Triton X-100, 10% DMSO e 3%BSA em PBS por cinco horas a 37 graus Celsius com agitação protegida da luz. Após a segunda lavagem, enxágue o tecido em um tubo contendo 10 mililitros de 0,2%Triton X-100 fresco, 10%DMSO e 3%BSA em PBS por 16 a 48 horas a 37 graus Celsius com agitação e proteção contra luz.
Seguido por uma lavagem de duas horas em 10 mililitros de PBS sozinho a 37 graus Celsius com agitação e proteção contra luz. Para a limpeza do tecido adiposo branco no final da lavagem PBS, mergulhe o tecido e 10 mililitros de uma série ascendente de concentração de etanol de envio para uma incubação de duas horas por concentração à temperatura ambiente com agitação protegida da luz como indicado. Na manhã seguinte, mergulhe o tecido em uma garrafa de vidro de 20 mililitros com uma tampa plástica contendo cinco mililitros de salicilolato de metila em um capô de fumaça.
O tecido adiposo branco ainda é claramente visível nesta fase. Agite o recipiente para protegê-lo da luz à temperatura ambiente por pelo menos duas horas. O tecido adiposo branco torna-se completamente transplantado.
Para imagens confocal 3D do tecido adiposo branco manchado e limpo montar uma câmara de imagem metálica equipada com um fundo de vidro e em um capô de fumaça transferir o tecido para a câmara. Encha a câmara com salicilato de metila fresco. Finalize o suporte da câmara adicionando um pequeno deslizamento de cobertura para estabilizar o tecido e um grande deslizamento de cobertura para fechar a câmara.
Coloque a câmara sobre um estágio de microscópio confocal invertido para imagens teciduais em baixa ampliação para gerar alguns mapas 3D cúbicos de centímetros de toda a amostra de tecido adiposo. Após a geração de mapas 3D, use um objetivo de ar de longa distância de 20X que fornece uma boa relação entre a resolução e a profundidade para selecionar várias áreas para amostragem de tecidos em uma ampliação mais elevada. Para segmentação celular, converta pilhas 3D no formato de software para liberar espaço de memória.
Antes de abrir o módulo celular do software. Altere a configuração de detecção de células para coloração da membrana plasmática e selecione o canal fluorescente do marcador usado para delinear a periferia celular. Em seguida, configure os limites, forneça uma gama dos tamanhos de células esperados e execute a segmentação.
Os efeitos da limpeza no tecido adiposo branco humano e rato podem ser observados a olho nu. A limpeza também melhora drasticamente a profundidade da imagem do tecido que é capaz de ser adquirido. E facilita toda a imagem 3D do tecido e a geração de mapas 3D a partir da ampliação 4X.
O mapeamento 3D permite ainda que a seleção de diferentes áreas de interesse seja adquirida a uma ampliação de 20X a uma profundidade de dois milímetros. A coloração específica de gotículas lipídicas e adipócitos pode ser alcançada usando anticorpos perilipin e anti-GLUT4, respectivamente. Os vasos sanguíneos podem ser detectados usando anticorpo CD31 ou injeção intravenosa de Lectin DyLight 649 pouco antes do sacrifício.
Macrófagos e células T podem ser visualizados usando anticorpos ficoerrinas anti CD301 e anticorpo azul anti TCR beta Pacífico. A rede nervosa periférica pode ser detectada usando anticorpo anti-tyrosine Hydroxylase. Utilizando essas rotulagens, a distribuição média de tamanho e tamanho dos adipócitos e a densidade da rede dos vasos sanguíneos dentro do tecido adiposo podem então ser determinadas.
É crucial seguir o tempo de ocupação como demonstrado, pois a má preparação da amostra não resultará em uma boa qualidade de imagem. Este protocolo pode ser combinado com sistema avançado de imagem ou pode ser acoplado ao freeware de análise de imagem pós-processamento.
