Estudos recentes têm destacado o papel crítico da angiogênese e da inovação solidária na remodelação do tecido adiposo durante o desenvolvimento da obesidade. Aqui demonstramos um método modificado de imunofluorescência que mantém eficientemente vasos sanguíneos e fibras nervosas no tecido adiposo. Nossa abordagem é direta e eficiente, sem compromisso com a eficiência permanente e a qualidade.
Nós adquirimos as imagens usando microscopia confocal. A alta resolução das imagens nos permite reconstruir as redes dos vasos sanguíneos e analisar com precisão suas características. Comece este procedimento com anestesia e perfusão de seis semanas C57 Preto-6J camundongos machos conforme detalhado no protocolo de texto.
Disseque problemas de adipose branco e marrom dos ratos. Use uma tesoura para quebrar as amostras de tecido em pequenos pedaços de pedaço. Transfira os pequenos pedaços com as pinças esterilizadas para o tecido incorporando fitas com rotulagem adequada das amostras de tecido nas fitas.
Mergulhe as fitas incorporadas contendo amostras de tecido na solução de fixação a quatro graus celsius por 24 a 48 horas. Transferir os pequenos pedaços foi uma pinça esterilizada em uma placa de Petri. Lave as amostras 3 vezes com tampão pbs de escova 1x a 0,5 mililitros por lavagem.
Agora corte as amostras de tecido fixo em aproximadamente dois cubos cúbicos milímetros com a tesoura esterilizada. Para permeabalização, transfira as amostras para um tubo de 1,5 mililitro contendo um mililitro de tampão TRIton PBS e gire suavemente os tubos à temperatura ambiente por 1 hora a 18 RPM. Após uma hora, remova cuidadosamente o tampão de 1%Triton PBS por aspiração, lave as amostras três vezes adicionando o PBS 1x diretamente nos mesmos tubos.
Durante cada lavagem, inverta os tubos várias vezes. Para o bloqueio, adicione 0,5 mililitro de tampão de bloqueio às amostras e incubadora em temperatura ambiente por duas horas com rotação suave. Para preparar 0,4 mililitros de solução de anticorpos primários, dilui dois microlitros de anti Endomusin e dois microlitros de anticorpos anti-tyrosine hidroxi lase até 396 microlitros de tampão de bloqueio.
Vórtice e girar para baixo para recuperar o volume. Agora, remova cuidadosamente o tampão de bloqueio dos pedaços de tecido. Adicione 100 microliters da solução de anticorpos primários preparados em tubos e incubar a quatro graus celcius durante a noite.
No dia seguinte, colete cuidadosamente a solução primária de anticorpos para reutilização, se desejar. Lave as amostras três vezes com 1x PBST a 500 micro litros por lavagem por 30 minutos com rotação suave a 18 RPM. Para a preparação da solução de anticorpos secundários, dilui dois microlitres de farinha de farinha conjugada anti-deus IGG em duas microlitres de farinha-farinhao conjugada anti-raivosa IGG em 396 microliters de tampão de bloqueio.
Vórtice e gire brevemente para coletar todo o líquido. Agora, remova o último tampão de lavagem das amostras. Adicione 100 microliters de solução de anticorpos secundários em tubos.
Incubar as amostras em temperatura ambiente por duas horas com rotação suave a 18 RPM. Depois de remover cuidadosamente a solução de anticorpos secundários, lave as amostras três vezes com 1x PBST a 500 microlitres por lavagem por 30 minutos cada uma com rotação suave a 18 RPM. Para desembaraço óptico, mergulhe as amostras em um mililitro de 90% Glicerol e mantenha as amostras a quatro graus celcius na escuridão até que se tornem transparentes.
Adicione aqui um isolador de silício ao slide para criar um poço para imagens de volume. Mantenha a altura do silicone para ou um pouco menor que a da amostra. Transfira cuidadosamente as amostras para o poço e encha-as com o meio de montagem.
Coloque uma mancha de cobertura na superfície e sele os quartos da tampa com meio de alta viscosidade. Deixe a montagem média cura por 24 horas em temperatura ambiente e escuridão. Após a cura estiver completa, sele totalmente as bordas do deslizamento de cobertura para uma melhor longevidade amostral.
Adquira imagens de pilha Z com o objetivo 20 vezes de um microscópio confocal e seu software correspondente. Inicie o sistema. Clique na guia de configuração e ative o laser Argon e o laser He-Ne 633.
Clique na guia de aquisição. No painel de linhas laser visíveis, mova os controles deslizantes de intensidade correspondentes para cima para escolher as linhas de laser até 488 nanômetros e 633 nanômetros. Inicialmente, as intensidades podem ser definidas para 20 a 30%Agora selecione o espelho dicroico triplo 488, 561, 633.
Ative os multiplicadores de fotos clicando nas caixas de seleção ativas. Escolha um fotomultiplier para a emissão exercida pelo laser de 488 nanômetros e fotomultiplier 34 para o do laser de 633 nanômetros. Defina o comprimento de onda entre 500 e 550 nanômetros para multiplicador de fotos um.
Em 650 a 750 nanômetros, para multiplicador de fotos três. Selecione a pseudo cor a ser usada para exibição de imagem clicando duas vezes no retângulo colorido ao lado de cada multiplicador de fotos e escolhendo uma cor no menu pop-up. Agora clique ao vivo para verificar a imagem nas amostras.
Use o nob de posição Z para selecionar um plano de foco dentro da região XY de interesse. Ajuste o brilho das imagens girando a intensidade do laser, ganho inteligente e deslocamento. Para cada canal de fluorescência, execute este ajuste sob o modo de exibição de tabela de procuração rápida.
Clique no botão de tabela de olhar rápido para cima para entrar no modo de tabela de procuração rápida no qual pixels saturados são exibidos em azul para ajudar na configuração do nível de brilho apropriado. Clique duas vezes no botão de tabela de olhar rápido para cima para voltar ao modo de exibição pseudocolor. Durante a varredura, gire o nob de posição Z no sentido anti-horário para mover o plano de foco para uma extremidade do volume de juros.
Em seguida, clique na ponta da seta para definir a digitalização e a posição. Gire o nó de posição Z no sentido horário para mover o plano de foco através do espécime para a outra extremidade do volume de juros. Em seguida, clique na ponta da seta inicial para definir a posição de início de varredura.
Ajuste o tamanho da etapa Z para três mícrons. Altere a qualidade da imagem selecionando um formato de 1024 até 1024, uma velocidade de 100 Hz e uma média de linha de dois. Selecione iniciar a aquisição de imagens da pilha Z Para a projeção máxima da pilha de imagens adquirida, clique na guia do processo e, em seguida, na ferramenta;selecione a projeção 3D e digite o máximo na lista de métodos sem alterações em X, Y e Z.Definir limiar a zero, clique em aplicar.
A intensidade máxima do volume Z será empilhada em uma imagem 2D que é exibida. Para analisar as imagens 2D via software de código aberto, abra as imagens empilhadas no software. Ajuste o diâmetro e a intensidade do vaso até que todas as estruturas dos vasos possam ser adequadamente selecionadas.
Selecione a análise de execução e exporte os dados seguindo a orientação do software. Para analisar as imagens 3D através do software de licença, abra os dados brutos das imagens com o software. Ajuste o limiar de intensidade e outros parâmetros até que as estruturas do vaso em cada camada do volume Z sejam devidamente segmentadas.
Skeletonize a pilha de imagens binarizada resultante para obter um gráfico especial. Analise as características do segmento selecionado e exporte os dados seguindo a orientação do software. A região distal foi epidídica tecido adiposo branco, a região medial do tecido adiposo branco subcutâneo dorsal lombar e a região medial do tecido adiposo marrom intra-escárculo foram coletados.
Após toda uma coloração de montagem, os troncos de tecido foram montados e imagens com o microscópio confocal. Mais vasos sanguíneos foram manchados positivamente. Com o anticorpo anti-Endomusin no tecido adiposo branco subcutâneo incubado por glicerol, sugerindo que a etapa de limpeza é fundamental para a coloração completa dos vasos sanguíneos.
Para determinar se os vasos sanguíneos e as fibras nervosas apresentam padrões diferentes entre os depos com este método, a coloração de fluorescência comunitária foi realizada em tecido adiposo com anticorpos com anti-Endomusina para mostrar vasos sanguíneos e com lasmo hidroxi anti-tyrosina para mostrar fibras nervosas. Curiosamente, os resultados mostram que eles eram significativamente mais vasos sanguíneos do que fibras nervosas em tecido adiposo marrom em comparação com tecido adiposo branco. Entre o tecido adiposo branco, o tecido adiposo branco subcutâneo exibiu maior densidade dos vasos sanguíneos do que o tecido adiposo branco epidídmico.
Note-se que, embora as fibras nervosas se expandissem em paralelo com os vasos sanguíneos, elas não apresentaram co-localização significativa. A área do vaso, o número de junções e o comprimento do tubo foram então medidos qualitativamente com o método 2D nestes três tipos de tecido adiposo e encontraram resultados semelhantes. Este método coda eficientemente vasos sanguíneos e fibras nervosas e tecido adiposo.
Soa como uma ferramenta útil para estudar a mudança dinâmica no tecido adiposo durante o desenvolvimento da obesidade. A boca poderosa hy-de é tóxica. Por favor, realize etapas P-ifa envolvidas em um contato de pele mais amplo e inalação e manuseie corretamente o P-ifa Porque os raios laser tornaram-se microscópios focais e ainda prejudicam o olho.
Evite a exposição ocular aos feixes provenientes do objetivo,
