Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da farmacologia de segurança cardíaca. Por exemplo, uma nova medicina humana tem o risco de modificar o ritmo cardíaco normal? A principal vantagem desta técnica é que ela pode avaliar um grande número de compostos rapidamente e a um custo moderado.
Demonstrando o procedimento será Camille Forny, uma pesquisadora associada no meu laboratório. Para se preparar para a medição das contrações da sincronia dos cardiomiócitos pluripotentes pluripotentes induzidos pelo homem, ou HIPSCCMs, comece colocando CrioTubes contendo células congeladas em um banho de água de 37 graus Celsius por dois minutos. Transfira toda a suspensão celular descongelada de cada tubo para um único tubo cônico fresco de 50 mililitros.
Para recuperar as células que sobraram, lave cada tubo com um mililitro de 37 graus Celsius pré-equipado e adicione este meio ao tubo cônico de 50 mililitros contendo células descongeladas. Adicione oito mililitros de meio de revestimento quente ao tubo e misture cuidadosamente a suspensão. Use o método de exclusão azul trypan e um hemócito para contar células vivas.
Adicionando meio de revestimento quente, ajuste a concentração para 50.000 células por mililitro. Para distribuir as células em duas novas placas de cultura celular de 384 poços, adicione 25 microliters a cada poço, o que renderá cerca de 12.500 células por poço. Incubar as células a 37 graus Celsius em placas de 384 poços na atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono por um total de três a quatro semanas.
No dia seguinte, substitua o meio de chapeamento por 50 microliters de meio de manutenção quente. Depois, substitua metade do meio de manutenção a cada dois ou três dias. Nos dias 7, 14 e 21, substitua totalmente o meio.
Uma vez que as células foram mantidas na cultura por três a quatro semanas, elas formaram-se espontaneamente contraindo sincronia, e o efeito dos compostos nessas contrações pode ser medido. No dia do ensaio, pelo menos duas horas antes da primeira placa de célula deve ser colocada dentro do leitor de placas para a medição, ligue o leitor e coloque o sistema de aquecimento a 37 graus Celsius. Para preparar as placas compostas, aqueça a temperatura ambiente 40 mililitros de meio de manutenção suplementados com estreptomicina penicilina de volume por volume de 1% em volume.
Enquanto o meio está se aquecendo, distribua os compostos de teste e os controles em duas placas compostas de 384 poços adicionando 1,5 microliters de solução de estoque por poço. Centrifugar as placas compostas a 100 G por um minuto. Adicione 37 microliters de meio de manutenção a cada poço e centrifufique as placas novamente a 100 G por um minuto.
Para preparar o corante fluorescente, aqueça 100 mililitros de meio de manutenção suplementados com estreptomicina penicilina de 1%volume por volume em um banho de água de 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 10 mililitros do meio aquecido à mistura de corante fluorescente sensível ao cálcio e quencher para reconstituí-los como um meio de fluorescência de estoque. Inicie o software do leitor de placas.
Prepare o software para gravar um segmento de dois minutos de ondas de cálcio com uma frequência de aquisição de pelo menos 10 hertz. Para tornar a fluorescência média para cada placa celular, dilui três mililitros de meio de fluorescência de estoque com 12 mililitros de meio de manutenção quente com antibióticos. Substitua 20 microliters de meio em cada poço da placa celular por 30 microliters de meio de fluorescência e misture por tubulação para cima e para baixo uma vez.
Imediatamente depois disso, coloque a placa em um leitor de placas para que os HIPSCCMs se ajustem à temperatura do leitor por 60 minutos. Em seguida, inicie o software do leitor de placas. Registo um segmento de dois minutos de ondas de cálcio com uma frequência de aquisição de pelo menos 10 hertz para definir a taxa de batida da linha de base para cada poço.
É importante garantir que a placa celular não seja transferida para fora do dispositivo após a aquisição de dados. Com algumas versões de software, você deve parar a gravação antes que ela termine completamente. Use o robô leitor de placas para pipetizar cinco microliters do teste e referenciar compostos bem-a-bem da placa composta para a placa celular.
Depois disso, inicie a aquisição de dados no software do leitor de placas para registrar dois segmentos de minutos de ondas de cálcio a partir de cinco, 15, 30, 45 e 60 minutos após a adição do composto. Para iniciar a análise dos dados, exporte os dados brutos para cada período de gravação do software do leitor de placas em arquivos de texto ASCII. E depois importá-los para o software de análise de dados.
A partir do software de análise de dados, exporte as frequências de batida primárias para cada período de gravação como cópias da área de transferência. Extrair a frequência de batida primária para cada poço e cada ponto de tempo. Finalmente, importe as frequências de batida em um software de planilha por meio da pastagem de área de transferência e continue a análise de dados conforme descrito no protocolo de texto.
O registro de ondas de cálcio na linha de base através de uma placa de 384 poços mostra que, na maioria dos casos, todos os poços revelam uma taxa de espancamento regular com pouca variabilidade em toda a placa. Quando os bloqueadores dos canais de íon cardíaco são adicionados, eles afetam o ritmo dos cardiomiócitos. Amlodipina, um bloqueador dos canais lentos de cálcio, acelera o ritmo mais de 100% de forma dependente de concentração até um micromolar.
E acima disso, amlodipina prende o espancamento. E-4031, um bloqueador dos canais de potássio retificador rápido desacelera o ritmo cerca de 65 a 70% de forma dependente de concentração até 10 micromolar. Tetrodotoxina, um bloqueador dos canais de sódio rápido desacelera o ritmo em cerca de 15% de forma dependente de concentração até um a 30 micromolar, enquanto acima de 30 micromolar, a tetrodotoxina prende o espancamento nos primeiros cinco minutos.
Bepridil, um bloqueador misto de canais cardíacos de sódio, cálcio e potássio também produz um efeito tudo ou nada, sugerindo que o bloco de canal de sódio é a ação primária do bepridil. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser extremamente gentil ao se desargar na placa de cultura celular. Estes tecidos são muito frágeis e facilmente danificados se tocados por pipetas.
Não se esqueça que trabalhar com células humanas e drogas ativas pode ser perigoso, e precauções como usar luvas de segurança e óculos devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
