Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a composição e organização dinâmica dos complexos proteicos fotossintéticos na membrana de tirokoóide vegetal. A principal vantagem dessa técnica é que permite a análise das interações funcionais entre complexos proteicos nativos e elucida a plasticidade da organização do complexo proteico em diferentes condições ambientais. Configure o rodízio de gel de oito centímetros por placas de 10 centímetros de acordo com as instruções do fabricante usando espaçadores de 0,75 milímetros.
Coloque uma batedeira de gradiente em uma placa de mexida e conecte-a com a bomba peristáltica por tubo. Coloque uma agulha de seringa na outra extremidade da tubulação e coloque a agulha entre o vidro e a placa de alumínio. Coloque um agitador magnético na câmara pesada.
Prepare soluções de centrífugo de 3,5% e 12,5% em tubos de centrífuga cônica de 15 mililitros, conforme detalhado no protocolo de texto a ser usado para o gradiente de gel de separação. Para evitar a polimerização prematura, mantenha os tubos de centrífugas no gelo enquanto prepara as soluções. Adicione 5%APS e TEMED logo antes de pippetar as soluções para o misturador de gradiente.
Pipetizar as soluções de 12,5% para a câmara pesada. Remova bolhas de ar do canal que conecta a câmara leve e pesada, abrindo a válvula que conecta as duas câmaras permitindo que a solução entre na câmara de luz. Feche a válvula e pipeta os traços da solução de volta para a câmara pesada.
Por fim, pipete a solução de 3,5% para a câmara de luz. Ligue o agitador magnético. Abra as válvulas e ligue a bomba peristáltica.
Permita que as soluções de gel fluam entre o vidro e a placa de alumínio a uma taxa de fluxo de aproximadamente 0,5 mililitros por minuto. A agulha deve estar acima do líquido o tempo todo. Quando as câmaras pesadas e leves esvaziarem-nas enchem-nas com água ultrapura.
E deixe a água sobrepor suavemente a superfície do gel. A polimerização do gel leva cerca de uma a duas horas em temperatura ambiente. Prepare a solução de acrilamida de 3% para o gel de empilhamento à temperatura ambiente.
Pipete o gel de empilhamento em cima do gel de separação polimerizada e coloque um pente de gel de amostra entre o vidro e a placa de alumínio evitando bolhas de ar. Depois de permitir que o gel polimerize por 30 a 60 minutos em temperatura ambiente, remova o pente suavemente sob água ultrauso. Neste ponto o gel pode ser armazenado a 4 graus Celsius positivos em condições úmidas por alguns dias.
Diluir timilóides isolados com tampão 25BTH20G frio para uma concentração final de clorofila de um miligrama por mililitro. Prepare dois tubos para cada amostra de tirokoide para realizar tanto beta-DM quanto solubilização de digitonina. Agora adicione um volume igual de tampão de detergente.
Misture o detergente e a tirola imola com uma pipeta e evite fazer bolhas de ar. Solubilize as tireilakoidas por dois minutos no gelo para a solubilização beta-DM. Ou 10 minutos em temperatura ambiente com mistura suave contínua em um roqueiro ou agitador para a solubilização digitonin.
Após a incubação, remova o material insolubilizado por centrifugação a 18.000 g durante 20 minutos a 4 graus positivos Celsius. Transfira o supernante para um novo tubo de 1,5 mililitro e adicione 1/10 de tampão azul brilhante Coomassie à amostra. Coloque o gel em um sistema de eletroforese vertical.
Encha a câmara tampão superior com tampão de cátodo azul e despeje o tampão de ânodo na câmara tampão inferior. Coloque as amostras de tirocoide nos poços. Inicie a eletroforese e aumente gradualmente a tensão conforme listado no protocolo de texto.
Execute o gel a 4 graus Celsius positivos usando uma sala fria ou ajustando a temperatura do gel com um sistema de resfriamento. Altere o tampão do cátodo azul para um tampão de cátodo claro quando a frente da amostra migrar cerca de 1/3 do gel. Após a execução eletroforética, escaneie o gel com um scanner fotográfico para arquivamento de imagens.
Para executar 2-SDS PAGE monte o sistema de eletroforese vertical usando espaçadores de um milímetro. Prepare um gel SDS padrão com um pente 2D descrito no protocolo de texto. Corte a pista do gel BN e coloque-a em um tubo de cinco mililitros.
Em seguida, adicione dois mililitros de tampão laemmli e incubar a tira por 45 minutos com agitação suave à temperatura ambiente. Coloque a pista com a ajuda de um espaçador em cima do gel evitando bolhas de ar. Pipeta cinco microliters de marcador de peso molecular em um pedaço estreito de papel filtro e colocar o papel no poço padrão.
Para selar a tira de gel BN e o papel marcador despeje uma 0,5% de agarose na execução do buffer em cima da tira de gel e permita que ela se solidifique. Realize eletroforese de acordo com os protocolos padrão. Após a corrida eletroforética visualize as proteínas com mancha de RUBI SUPRO ou coloração de prata.
Resultados representativos de padrões complexos de proteínas de tiroilakoide de beta-DM e amostras de digitonina-solubilizada são mostrados aqui. Os pequenos complexos migram mais rápido durante a corrida eletroforética e, portanto, estão na parte inferior do gel. Enquanto os grandes complexos estão na parte superior do gel.
A digitonina geralmente preserva complexos proteicos em conjuntos maiores, enquanto o DM beta interfere com interações proteína-proteína labile entre os complexos. A composição subunidade de complexos proteicos de beta-DM e thylakoids digitalonin-solubilizadas são apresentadas aqui. As subunidades de cada complexo são encontradas a partir da linha vertical abaixo do complexo alinhado.
Em princípio, cada ponto no gel 2D representa uma proteína individual. Mas, na prática, várias proteínas da mesma massa molecular podem estar presentes em um único ponto. A identificação das manchas baseia-se na análise de espectrometria de massa.
Após a aplicação deste procedimento pode-se continuar com outros métodos como microscopia eletrônica e análise de partículas únicas dos complexos proteicos eludidos do gel nativo azul, a fim de obter insights estruturais sobre os complexos proteicos. Para identificar subunidades proteicas desconhecidas, os pontos proteicos individuais do SDS PAGE bidimensional podem ser analisados com especificação de massa. Não se esqueça que trabalhar com acrilamida e digitonina pode ser extremamente prejudicial e precauções como o uso de luvas de proteção devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
