Este método é útil para responder a certas perguntas-chave no campo da pesquisa da fotossíntese, como se os complexos putakoóides fisiologicamente reais com componentes energeticamente conectados? A principal vantagem do gel verde e do protocolo TCSPC descrito aqui é que ele é rápido e robusto. As amostras podem ser facilmente processadas e analisadas em um único dia, tornando as questões de armazenamento e estabilidade menos preocupantes.
Embora o TCSPC possa fornecer informações sobre os sistemas fotossintéticos que estudamos aqui, ele também pode ser aplicado a outros sistemas que vão desde químicos até físicos e biológicos, como estudos de movimento molecular fluorescente em líquidos, células ou motivos estruturais novos, como camadas monomoleculares e líquidos iônicos. Para iniciar este procedimento, prepare as soluções de estoque necessárias e mini géis verdes conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, obtenha um pouco de gelo e apague as luzes.
Usando um homogeneizador do Dounce de vidro, homogeneize completamente as folhas de espinafre em aproximadamente um a dois mililitros de tampão TMK. Para criar um simples dispositivo de filtragem, corte uma tarefa delicada ao meio e dobre-a em trimestres. Remova o êmbolo de uma seringa e, em seguida, embale a tarefa dobrada limpe na parte inferior da seringa.
Pipetar a folha homogeneizar-se no centro do filtro de limpeza de tarefas, em seguida, use o êmbolo para passar o homogeneizar através do filtro e colecioná-lo em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugar o homogeneizar a 5.000 g e quatro graus Celsius por 10 minutos para pelotar o material insolúvel, incluindo as membranas de tirokoide. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em um mililitro de tampão TMK.
Para extrair clorofila de cada amostra, pegue uma alíquota de 50 microliter e transfira-a para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 950 microliters de metanol, tampa o tubo e misture invertendo-o várias vezes. Centrifugar a 10.000 g por 10 minutos para pelotar as proteínas precipitadas.
Utilizando as medidas de concentração de clorofila como guia, remova e descarte algum volume de cada amostra conforme necessário até que cada tubo contenha a mesma quantidade total de clorofila. Centrifugar a 5.000 g por 10 minutos para re-pelotar as membranas de tirokoóide. Remova e descarte o supernasce, tomando cuidado para remover todo o supernatante sem perturbar a pelota.
Primeiro, descongele uma alíquota de solução de detergente TMK 30%glicerol. Inverta várias vezes para misturar e manter a solução no gelo. Adicione um volume apropriado da solução de detergente para dissolver a pelota e resultar em uma concentração final de clorofila de um miligrama por mililitro.
Pipeta para cima e para baixo repetidamente enquanto é cuidadoso para evitar espumar na amostra. Em seguida, mantenha a amostra no gelo para permitir que as amostras de tiroakoide solubilizem. Após a solubilização completa, centrifugar a amostra a 10.000 g e quatro graus Celsius por 10 minutos para pelotar o material insolúvel, resultando em um supernatante verde claro e escuro.
Depois disso, carregue 15 microliters de supernanato de tirokoide solubilizado diretamente em cada poço de um gel nativo de 1,5 milímetros previamente preparado. Usando tampão de corrida 1X, comece a executar o gel verde nativo a 100 volts. Coloque todo o tanque de gel em gelo molhado durante a corrida para mitigar o aquecimento resistivo.
Quando o gel terminar de funcionar, remova-o da célula de eletroforese e enxágue o tampão de corrida das placas de gel com água destilada. Retire a placa superior do gel e enxágue o gel com água destilada. Coloque o gel, que ainda está na placa de vidro inferior, no gelo;quando o gel não estiver em uso, cubra-o com plástico e mantenha-o no escuro para evitar que ele seque.
Em seguida, use um bisturi afiado ou lâmina de barbear para extirpar cada faixa de interesse quando estiver pronto para prosseguir com a análise TCSPC. Certifique-se de que a banda excised não contém material de banda contaminante. Para cada complexo analisado, use um espectrômetro fluorescente para fazer um espectro fluorescente de temperatura ambiente entre 600 e 800 nanômetros.
Coloque fita adesiva em cada extremidade dos slides e dobre-a várias vezes para criar espaçadores, o que permitirá que os slides sejam mantidos juntos firmemente sem comprimir o espaço entre eles, em seguida, sanduíche a fatia de gel entre dois slides de microscopia de vidro. Adicione uma pequena quantidade de água à fatia de gel na borda dos slides de vidro para criar uma interface lisa que reduzirá a dispersão de sinais. Em seguida, aperte o sanduíche de gel no caminho do feixe para que o feixe atinja a fatia de gel através da borda aberta das placas.
Para cada complexo, colete 10.000 pontos de dados totais em intervalos regulares em todo o espectro de emissões de fluorescência. Para analisar os dados para um determinado complexo, primeiro normalizar a altura máxima de cada curva de decomposição para todos os comprimentos de onda coletados, em seguida, a cauda corresponde a cada curva de decaimento ao espectro de fluorescência de estado constante do complexo, conforme descrito no protocolo de texto. Resultados representativos para a eletroforese de gel verde fornecem um exemplo de um resultado ideal para a análise de timilarias de espinafre, onde uma série de faixas verdes claras e afiadas são visíveis.
As faixas 2 e 3 apresentam resultados mais típicos do simples isolamento da tireilaboida e da eletroforese em um gel de acrilamida não gradiente de 5%. As faixas 4, 5 e 6 fornecem um exemplo de resultados ruins devido ao aumento dos graus de solubilização da amostra de tirokoide, enquanto a faixa 7 demonstra os resultados que podem ser alcançados quando os tiroxilarias arabidopsis são usados em vez de espinafre. Depois que as curvas de dados dos dados do TCSPC foram definidas para o mesmo registro de tempo, elas podem ser normalizadas para a mesma altura máxima, o que permite que as curvas sejam comparadas como uma primeira análise dos dados.
Curvas de decadência normalizadas de diferentes complexos podem então ser sobrepostas umas com as outras em um determinado comprimento de onda, permitindo que as diferenças de comportamento entre os complexos sejam visualizadas. A cauda que corresponde às curvas de decomposição permite a construção de espectros associados à decomposição. Como visto aqui, o espectro associado à decadência para o LHCII é notável pela falta de recursos dinâmicos e a forma do espectro de fluorescência LHCII permanece a mesma que o sinal decai ao longo do tempo.
A decomposição do espectro da fluorescência também está atrasada, exigindo 100 picosegundos para atingir a fluorescência máxima. Isso sugere que a energia não é transferida entre pigmentos energeticamente distintos dentro do complexo à medida que a fluorescência decai. O espectro associado à decadência é então construído para o complexo da Banda 5.
Em comparação com o LHCII, a fluorescência da Banda 5 decai muito mais rapidamente, atingindo intensidade máxima em apenas 30 picosegundos e, em seguida, decading para menos de 20% da intensidade inicial após 500 picosegundos. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar que a interpretação dos dados do TCSPC dependerá de informações bioquímicas adicionais que identifiquem os componentes dos complexos em estudo, por exemplo, por 2 DSDS-PAGE e Western Blotting ou espectrometria de massa.
