Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da microbiologia, como como o fluxo de fluidos altera o crescimento e o desenvolvimento de biofilme fúngicos. A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite avaliar quantitativamente os efeitos do fluxo no crescimento e desenvolvimento de biofilme em tempo real. Inicie este experimento com a montagem do aparelho de fluxo, conforme descrito no protocolo de texto.
No dia do experimento, conecte a armadilha da bolha, a sonda de temperatura e todos os componentes de uso único. Para montar o filtro, remova o êmbolo de uma seringa de um mililitro para torná-lo um adaptador. Force a tubulação da garrafa do filtro para esta extremidade e conecte um filtro de 2 mícrons ao tubo que leva ao frasco de crescimento.
Aplique graxa de vácuo de silicone ao redor da barb do adaptador de lâmina antes de conectá-lo, pois isso ajuda a evitar vazamentos de ar no sistema. Encha o frasco de fixação com 100 mililitros de YPD, e encha o frasco de crescimento com 200 mililitros de YPD. Certifique-se de que a tubulação lateral verde atinja a mídia em cada frasco.
Certifique-se de que todas as válvulas estão abertas. Conecte a armadilha da bolha a um vácuo e conecte a bomba ao tubo lateral verde rio abaixo da armadilha da bolha. Bombeie o fluido a uma vazão de 3,3 mililitros por minuto para encher completamente o lado verde.
Em seguida, dispense e descarte aproximadamente um a dois mililitros da mídia, porque o primeiro par de mililitros geralmente contêm células mortas ou detritos aleatórios. Certifique-se de que o lado verde da tubulação está cheio de mídia e não tem bolhas a jusante da armadilha de bolhas antes de prosseguir. Encha o slide do canal e o reservatório com YPD, tomando cuidado para não introduzir bolhas.
Conecte o slide ao aparelho de fluxo. Em seguida, bombeie mais fluido para criar um tampão de cerca de 5 metros no lado laranja. Isto é para evitar a captura acidental de ar no slide em caso de backflow.
Agora, prepare o aparelho de fluxo para o transporte para o microscópio, primeiro plantando a entrada e a saída da armadilha de bolhas fechada. Em seguida, fixe as válvulas de frasco de fixação lateral verde e laranja fechadas. Certifique-se de que as tampas do parafuso para o amortecedor de pulsação e a garrafa do filtro estão apertadas, pois elas podem se soltar durante a autoplacação.
Desconecte a bomba da tubulação para facilitar o transporte. Em seguida, mova todos os componentes, incluindo o agitador de placa quente, para um recipiente secundário perto do microscópio. Conecte a sonda de temperatura ao agitador de placa quente e comece a aquecer o frasco de fixação a 37 graus Celsius.
Mexa a mídia a 300 RPM, e mantenha isso durante todo o experimento. Monte o slide no microscópio e use a fita, se necessário, para fixá-lo firmemente. Em seguida, anexar a armadilha bolha a um vácuo.
Agora, conecte a bomba ao aparelho de fluxo. Inicie a bomba a uma vazão de 3,3 mililitros por minuto e deixe-a funcionar por aproximadamente cinco a 10 segundos. Então, remova a armadilha da bolha no clã da tampa solta.
Deixe a bomba continuar funcionando enquanto o frasco de fixação aquece. Uma vez que o frasco de fixação e a câmara de incubação estejam ambos a 37 graus Celsius, adicione cultura suficiente durante a noite das células fúngicas ao frasco de fixação para alcançar um milhão de células por mililitro. Aguarde 15 minutos para permitir que as células se aclimatem.
Abra as válvulas de frasco de fixação lateral verde e laranja enquanto fecha ambas as válvulas de frasco de crescimento para iniciar o fluxo das células. Aguarde aproximadamente cinco minutos para permitir que as células cheguem ao slide. Durante esse tempo, concentre o microscópio e ajuste-o aos mesmos parâmetros de imagem usados em experimentos anteriores.
Inicie a aquisição de imagens para a fase de anexo. Volte depois de aproximadamente cinco e 10 minutos para garantir que o foco tenha sido mantido. Se não, tente ajustar o foco imediatamente após a próxima imagem ser adquirida.
Imediatamente após o término da fase de anexo, salve o arquivo. Em seguida, abra as válvulas de frasco de crescimento do lado verde e laranja enquanto fecha ambas as válvulas de frasco de fixação. Tome cuidado para não bater o palco se houver válvulas dentro da câmara de incubação.
Desligue a sonda do termômetro e substitua o frasco de fixação pelo frasco de crescimento. Agora, configure o software para adquirir uma imagem a cada 15 minutos ao longo de 22 horas, e iniciar a aquisição de imagens para a fase de crescimento. Uma vez concluída a fase de crescimento e o arquivo foi salvo, abra as válvulas de frasco de fixação lateral verde e laranja, o que pode fazer um ruído à medida que a pressão é liberada no lado laranja.
Puxe para cima na tubulação lateral verde vindo de ambos os frascos de mídia, até que eles estão pelo menos vários centímetros acima da mídia. Em seguida, execute a bomba em alta velocidade para remover toda a mídia da tubulação, o que torna a limpeza muito mais fácil. Finalmente, quantifique os vídeos conforme descrito no protocolo de texto.
Este vídeo de microscopia de campo escuro mostra a fixação de células albicanas do tipo selvagem Candida ao subfluxo do substrato durante a fase de apego, seguido pelo crescimento e desenvolvimento subsequentes durante a fase de crescimento que levou à formação de biofilme. Os dados desses vídeos podem ser analisados para as taxas de apego celular e descolamento e biomassa ao longo do tempo, mostrados aqui é a biomassa total dentro da região de imagem, conforme determinado pela análise de densitometria. A taxa cumulativa de apego celular e o desprendimento percentual de biomassa ao longo do tempo também são mostrados.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar as mesmas condições de imagem em todos os experimentos, pois isso permite que comparações quantitativas sejam feitas entre eles.
