Aqui apresentamos o NETQUANT, uma abordagem totalmente automatizada para quantificar as imagens de NETS e imunofluorescência. Isso ajudará os pesquisadores a fazer análises de imagem comparáveis a partir de dados gerados por vários usuários e condições. As vantagens dessa técnica são a facilidade de uso, análise de dados unicelulares, múltiplos critérios para avaliar a formação de NET e uma análise imparcial de múltiplas imagens.
Instale e abra o software de análise. Uma versão atualizada pode ser encontrada no arquivo Zenodo GitHub ou no site do Nordonfelt Lab. Na guia de configuração, escolha uma pasta de origem para análise clicando na opção obter caminho no menu de origem.
Selecione a pasta contendo as sequências de imagem a serem analisadas. Novamente, clique na opção obter caminho no menu de destino e selecione a pasta de destino para salvar os dados após a análise de imagem. Em seguida, ao usar imagens de canal separadas, nomeie as pastas do canal para que o canal de DNA corresponda à mancha de DNA nuclear, e o canal NET retrata a mancha de elastase de neutrófilo nas imagens.
Além disso, nomeie a pasta contendo os arquivos de imagem de controle como controle. Em seguida, clique no botão de informações de imagem de carga e carregue os metadados de imagem para o software. Em seguida, no subempreso de ordem de canal, selecione a ordem de canal correta contida nas imagens.
Isso ajuda a evitar incompatibilidades acidentais. Agora clique no botão preparar dados para adquirir propriedades de imagem primária a partir dos dados brutos e converter as imagens. As imagens convertidas aparecerão no subempresa dos tipos de amostra.
Clique no menu de tipo de amostra, selecione uma imagem no subempômo e clique em exibir dados de imagem para exibir as imagens divididas no DNA e na Armadilha Extracelular de Neutrófilos, ou canal NET, respectivamente. Para segmentar as células em seus respectivos canais, selecione a guia do método de segmentação e selecione um método no subempísula do método tanto para o DNA quanto para os canais NET. O método padrão de segmentação é definido como adaptável e é a configuração recomendada.
Outras opções estão disponíveis no software, incluindo borda global e chanverse. Uma opção de bacia hidrográfica também foi incluída para ajudar a distinguir entre células estreitamente colocadas ou NETs. Também na guia de segmentação, clique na opção de amostras de controle do segmento.
Em seguida, selecione PMA no subem menu do tipo de amostra e clique na opção lote para iniciar a segmentação de todas as imagens incluídas no conjunto de dados. Em seguida, selecione as imagens no menu de tipo de amostra e clique no botão de dados da imagem do display para visualizar e validar as máscaras de imagem binárias tanto para as máscaras DE DNA quanto para NET geradas após a segmentação. Agora, na guia de análise, clique no botão determinar limiar para analisar as amostras de controle.
Em seguida, no lado direito, altere o tipo de amostra para PMA e clique no botão obter propriedades celulares para completar a análise das amostras estimuladas. Em seguida, selecione uma imagem no subem menu do tipo de amostra e clique no botão de dados da imagem de exibição para exibir a sobreposição e o número de células e células formadoras de NET na imagem. Comece selecionando a amostra no subempreso tipo de amostra.
Imagens individuais podem ser selecionadas no subempreso do tipo de amostra para análise ou todo o lote de imagens pode ser analisado selecionando a opção de lote. Uma vez selecionado, clique no botão analisar NETs para concluir a análise. Ajuste os critérios NET manualmente para produzir resultados ideais para uma determinada amostra.
Compare os NETs identificados com as imagens originais para avaliar a qualidade da identificação. Uma vez concluída esta etapa, os critérios NET podem ser aplicados em todas as imagens do conjunto de dados. Quaisquer alterações feitas nos critérios net também são aplicadas simultaneamente a todas as amostras de controle.
Inspecione o resumo de dados no subempeso de dados da célula, onde o número de imagens, a contagem de células por imagem e a porcentagem de NETs por imagem são exibidos. Digite a guia de saída para selecionar e visualizar as saídas de resultado. Explore e compare as várias saídas de dados geradas a partir da análise de amostras tratadas com controle e PMA, selecionando a forma da saída e clicando no botão de resultados de saída.
Em seguida, inicie o arquivo CSV da tabela de dados de resultados para explorar dados unicelulares e clique nos resultados arquivos PDF para visualizar a distribuição da área NET e a relação DNA para NET nas amostras. A linha vermelha indica o valor do limiar nos gráficos. Por fim, clique no arquivo de distribuição bivariado dos resultados para determinar a área NET versus forma de DNA.
Aqui, 15 imagens de neutrófilos de controle e 15 imagens de neutrófilos estimulados pela PMA foram analisadas em menos de dez minutos. O número total de células foi contado e a porcentagem de células com Armadilhas Extracelulares De Neutrófilo foi determinada utilizando o método automatizado de quantificação descrito neste artigo. Esses resultados mostram que os neutrófilos estimulados pelo PMA têm uma área maior, um aumento na deformação nuclear e uma maior proporção de DNA para NET do que as amostras de controle.
Quando combinadas em um gráfico 3D, as amostras estimuladas pelo PMA tendem a mostrar áreas de agrupamentos mais apertados do que as amostras de controle. Ao tentar o procedimento, é importante lembrar que, embora o fluxo de trabalho tenha sido testado usando vários doadores, recomenda-se que o usuário decida sobre os parâmetros do software adequadamente com base no conjunto de dados individuais.
