Agradecemos Andreas Radbruch pelas valiosas discussões. Somos gratos a Sabine Gruczek, Patrick Thiemann e Manuela Ohde para assistência com cuidados com os animais e Robert Günther para excelente assistência técnica. Agradecemos aos nossos avaliadores treinados Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Florence Pache e Katharina Chifre para avaliação das amostras histológicas e Randy Lindquist para revisão do manuscrito. Agradecemos J. e N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, EUA para anticorpos MBP-específicas. Este trabalho foi apoiado por DFG HA5354 / 4-1, por JIMI-a concessão da rede facilidade DFG núcleo para microscopia intravital e por TRR130 / TP17, e DFG PARA 2165 (HA5354 / 6-1) para AEHSZ foi apoiado pelo Max Planck Internacional Escola de Doenças Infecciosas e Imunologia (IMPRS-IDI), Berlim.

As experiências com animais foram aprovados pelos comitês estaduais apropriadas para bem-estar animal (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) e foram realizados de acordo com as diretrizes atuais e regulamentos (licença de experiência com animais G0194 / 11). 1. Produção de fluorescente de Medula Óssea Ratos quiméricos NOTA: A geração de medula óssea fluorescente ratinhos quiméricos para visualizar as células do estroma da medula óssea é realizado tal como descrito antes 9. <ol><li> Iniciar o tratamento Del-Cre x ratos ROSA-tdRFP (camundongos que expressam a proteína fluorescente vermelha em tandem (tdRFP) ubíqua 11-13) para prepará-los para a irradiação. Como alternativa, use qualquer outra estirpe com expressão ubíqua da proteína fluorescente. Administrar 1 mg / ml de neomicina e 1 mg / ml de vitaminas (A, D3, E, C) através da água de beber, dois dias antes da irradiação. </li><li> Irradiar ratos duas vezes com 3.8 cinza com um Césio-137 gamma-irradiador wifina um intervalo de 3 horas. Para este efeito, colocar ratinhos em uma gaiola de torta de irradiação adequados para o respectivo irradiador. NOTA: Para a irradiação de ratos, o Instituto não requer anestesia. Siga as políticas institucionais locais referentes à anestesia para irradiação. Tratar os animais com 5 mg / kg por via subcutânea de carprofeno (sc) por dia após a irradiação, se há sinais de dor. </li><li> No dia seguinte, reconstituir os ratos com uma injecção intravenosa de 3 x 10 6 células da medula óssea preparadas a partir de ossos longos de ratinhos C57BL / 6 dadores em tampão de transferência 9. Mantenha os ratos sobre Neomicina e vitaminas para até 2 semanas e acompanhar o seu bem-estar e de peso durante este tempo. Aguardar pelo menos 4 semanas para permitir a reconstituição do sistema imunológico, antes de iniciar os tratamentos experimentais específicos (por exemplo, a imunização) 9. </li><li> Sacrifício camundongos e colocá-los em uma placa de dissecação, esterilizar as pernas com etanol 70%. Euthanize camundongos, em conformidade com as políticas institucionais locais. Nosso Instituto realiza luxação cervical. </li><li> Use fórceps e tesouras para remover a pele das coxas. Remover o tecido muscular para expor o osso femoral. Desarticular o osso femoral a partir do quadril e joelho usando uma pinça e tesouras. Tenha cuidado para não quebrar ou cortar o osso. </li><li> Remova cuidadosamente restantes grandes pedaços de tecido muscular e da cartilagem do osso usando uma tesoura. Remover o tecido muscular remanescente por fricção com o osso papel de seda laboratório. Recolher os ossos limpos em um prato de petri com salina tamponada com fosfato (PBS). </li><li> Corrigir os ossos do fêmur inteiras em 4% de paraformaldeído (PFA, microscopia eletrônica-grade) para 4-6 horas. </li><li> Descartar PFA e incubar ossos em 10% de sacarose em PBS S / N. No dia seguinte, incubar os ossos em 20% de sacarose S / N. Um dia depois, incubar os ossos em 30% de sacarose O / N. </li></ol> 2. cryosectioning of Bones NOTA: Após 16-24 h em 30% de sacarose, congelar os ossos e criocorte-los de acordo com o método de fita de Kawamoto 14,15. <ol><li> Prepara-se uma proveta grande (2,000 ml de volume) com gelo seco e acetona (cerca de 2: 1 ratio de volume, por exemplo, 400 ml de gelo seco e 200 ml de acetona) sob uma coifa. Coloque um copo pequeno (150-250 ml de volume) com hexano dentro (30-50 ml aproximadamente). Esperar para a mistura arrefecer para baixo (aproximadamente 10 min, até a geada aparece no exterior da proveta grande). </li><li> Preencha ¾ do cryomold marcado com Super Cryoembedding Médio (SCEM); coloque cuidadosamente os ossos dentro até que sejam totalmente imersa, tomando cuidado para que eles não se tocam as bordas do molde. Com grandes fórceps segurar o cryomold dentro do copo que a parte inferior do molde apenas tocando a superfície do hexano. <ol><li> Deixe as bordas exteriores do congelamento SCEM (indicado pela opacidade, isto leva cerca de 15 segundos). Em seguida, solte completamente o molde para o hexano e deixá-lo freeze por 1-2 min. Retire a amostra congelada e embrulhe em papel celofane e, em seguida, uma folha de alumínio (para proteger a amostra de secar e para evitar a exposição à luz). Armazenar a -80 ° C até cryosectioning. </li></ol></li><li> Para cryosectioning dos ossos do fêmur usar um micrótomo e micrótomo padrão folhas de tecidos duros. </li><li> Regule a temperatura da amostra e lâmina do micrótomo a -24 ° C. Deixe a amostra sentar dentro do microtome por cerca de 15 min antes do corte. <ol><li> Fixe o bloco de amostra para o titular da amostra de metal com SCEM ou a temperatura de corte ideal (OCT) médio. Ajustar a orientação do bloco, se necessário. Apare a amostra até que o osso está totalmente aberta e a medula é visível. Ajuste a espessura de corte de 7 mm (rejeitar a primeira seção). </li><li> Fixe um pedaço de fita Kawamoto com o lado adesivo na parte superior do bloco de amostra, utilizando uma espátula de madeira veado couro-coberto. Subsequentemente, a amostra cortada e ligar a fita de modo que a secção éLocalizada no lado de cima. Transfira a fita para uma lâmina de vidro usando uma pinça. Fixe a fita para a lâmina de vidro com fita Scotch. </li></ol></li><li> Deixe secções secar durante pelo menos 30 min e armazená-las a -80 ° C até utilização. Guarde as lâminas não coradas e desmontados em caixas de plástico slide com espaçadores entre os slides individuais, a fim de evitar que elas se unem. Coradas e montadas lâminas podem ser armazenadas por até uma semana em papelão pastas de slides, a 4 ° C. </li></ol> Coleção 3. Imagem <ol><li> Descongele e criosecções mancha de acordo com protocolos de imunofluorescência comuns 9. Incluir um corante nuclear, por exemplo, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole dicloridrato (DAPI) para visualizar a integridade do tecido. NOTA: mancha, por exemplo, para RFP para visualizar as células estromais eosinófilos mancha com anti-proteína básica principal (MBP) e anticorpo de rato anti-rato Alexa Fluor 647-anticorpo (anti-anticorpos biotina-RFP e estreptavidina-Alexa Fluor 555), , células Bcom anticorpo de rato anti-B220-Alexa Fluor 594 anticorpo e PCs com luz anti-cadeia κ-fluoresceína-iso-tiocianato (FITC) e anticorpos anti-FITC-λ1 cadeia leve (pormenores do procedimento de coloração são descritos em 9). </li><li> Monte secções coradas: colocar uma gota de Fluoromount na seção e, em seguida, cubra com uma tampa de vidro # 1 deslizamento, evitando cuidadosamente a formação de bolhas de ar. Subsequentemente, realizar microscopia confocal de varrimento a laser com um instrumento equipado com linhas de laser adequados para a coloração. </li><li> Para gravar imagens para análise de co-localização automatizada de células hematopoiéticas da medula óssea com células estromais usando a ferramenta Wimasis, aplicam-se as seguintes definições: <ol><li> Usar uma lente da objectiva de 20X e um campo de visão de 708,15 x 708,15 mm. Para a análise automatizada, manter o tamanho de todas as imagens consistentes a 2.048 x 2.048 pixels (px), a fim de manter os resultados comparáveis. </li><li> Grave um canal para estruturas do estroma (por exemplo, </em&gt; 561 nm, linha de laser), um canal para núcleos (por exemplo, DAPI, a 405 nm) e canais adicionais para as células hematopoiéticas de interesse (por exemplo, três canais, 488/594/633 nm para eosinófilos, células B e PCs). </li><li> Gravar imagens utilizando linha média de 4 16. O ideal é cobrir toda a seção femoral tomando imagens adjacentes de solteiro. Alternativamente, tirar fotografias não adjacentes de diferentes regiões da medula óssea (diafisária bem como epifisária). NOTA: Tenha cuidado para não produzir sobreposições entre imagens adjacentes (para evitar a análise repetida de células nas áreas de sobreposição). </li></ol></li><li> Salve as imagens em um formato de arquivo de imagem de microscopia. Verifique e, se necessário, ajustar o contraste para todos os canais no software Visualizador de Imagens / análise. </li><li> Exportação 3 arquivos .jpg por arquivo de imagem: um arquivo .jpg para o canal DAPI (/ verde / azul formato vermelho (RGB), falso código de cor amarela), um arquivo .jpg para o canal de estroma (escala de cinza) e um .jpg arquivo contendoos canais de células hematopoiéticas (máximo de 3 canais, em formato RGB, por exemplo, FITC (PCs, cor falsa: verde) / Alexa Fluor 594 (células B, cor falsa: azul) / Alexa Fluor 647 (eosinófilos, falsa cor: vermelho)) . </li></ol> 4. Automated Análise de Imagem <ol><li> Use uma ferramenta de análise de imagem para realizar segmentação de imagens, quantificação de co-localização e análise de vizinhança (ver Discussão). </li><li> Se estiver usando as ferramentas Wimasis, faça o seguinte: <ol><li> Carregar os conjuntos de 3 ficheiros.jpg por imagem com o mesmo nome de ficheiro seguido por um sublinhado e um número que indica o tipo da imagem. </li><li> Use _1 para o arquivo .jpg com células hematopoiéticas, _2 para o arquivo .jpg para o canal DAPI, _3 para o arquivo .jpg para o canal de estroma. Por exemplo: Image1_1.jpg (células hematopoiéticas), Image1_2.jpg (canal DAPI), e Image1_3.jpg (canal de estroma). Faça o upload das imagens através da conta do cliente. </li><li> Para contato celular quantificaçãoescolha a ferramenta de contato celular, clicando no respectivo campo. Para arredores célula quantificação, escolha a ferramenta vizinhança da célula e introduzir o raio arredores preferido em um (que é medida a partir de bordas das células). </li><li> Faça o download dos resultados. NOTA: Os resultados são fornecidos como ficheiros.jpg que mostram as células hematopoiéticas e do canal de estroma com os limites dos objectos detectados realçada, assim como ficheiros.csv individuais contendo as medições para cada imagem, para além de uma síntese que .csv contém os dados para todas as imagens enviadas. </li></ol></li><li> A partir do contato medições determinar a freqüência de células hematopoiéticas (vermelho, verde, azul ou células) em contato com as células estromais, ou as freqüências de células vermelhas, verdes, azuis ou entrar em contato com os outros tipos de células hematopoiéticas (Um exemplo é mostrado em resultados representativos , Figura 4). A fim de determinar as freqüências, dividir as contagens de contato dadas por imagem poro total de células conta por imagem. <ol><li> Para as experiências com ratinhos individuais, soma-se as contagens totais de contacto de todas as imagens para os ratinhos individuais e dividi-los pela soma das contagens de células totais de todas as imagens. </li></ol></li><li> A partir das medições arredores, determinar a frequência de células vermelhas, verdes ou azuis na distância seleccionada a partir de células estromais e / ou as frequências de células vermelhas, verdes ou azuis na proximidade preferido para os outros tipos de células hematopoiéticas, tal como descrito no passo 4.3 ( ver também resultados representativos, figura 4). </li></ol> 5. Simulação da Random Medula Óssea Posicionamento <ol><li> Antes de executar as simulações de posicionamento celular aleatória nas imagens histológicas de medula óssea analisados, preparar os seguintes arquivos com antecedência: os únicos arquivos .csv fornecidos pela ferramenta de contacto das células, os arquivos .jpg originais para o canal DAPI e os arquivos .jpg originais para o canal do estroma. </li><li> A fim de realizarsimulações de grupo em uma série de imagens (por exemplo, todas as imagens a partir de uma seção femoral), recolher todos os arquivos .jpg originais (_1, _2 e _3) e os correspondentes arquivos .csv individuais em uma pasta. NOTA: A ferramenta de simulação para o posicionamento de células de medula óssea aleatória está disponível mediante solicitação. </li><li> Inicie a ferramenta de simulação, marque a caixa &quot;Auto-load de dados de imagem&quot;. NOTA: O programa irá ler as contagens de células e tamanho médio das células a partir do arquivo .csv automaticamente. Estes valores são exibidos nas caixas para &quot;número de celular&quot; e &quot;tamanho celular AVG&quot; (Figura 5A). </li><li> Digite o tag comum para os arquivos .csv, ou seja, o fator comum em seus nomes. Digite o número de conjuntos de imagens que devem ser usados ​​para a simulação de modo batch. </li><li> Carregar o arquivo .jpg gerado a partir do canal de estroma (com nome terminando _3). </li><li> Introduza as definições para gerar a máscara do canal DAPI: <ol><li> Marque a caixa &quot;? Aplique a máscara &quot;Definir o limite para converter a imagem DAPI em uma máscara binária a 10 (faixa de 0 - 255). </li><li> Marque a caixa &quot;8-bit?&quot; Marque a caixa &quot;Dilate?&quot; E defina o grau de dilatação a 5 px. Marque a caixa &quot;w / erosão?&quot;. </li><li> Entre o valor desejado para o raio da vizinhança (raio bairro) utilizado para a análise das imagens simuladas. Para uma imagem de 708,15 x 708,15 mm com um tamanho de 2048 x 2048 px (pixel de escala xy: 0,346 mm), 29 px correspondem a 10 um. </li></ol></li><li> Caixa de seleção &quot;Usar Otsu?&quot;, Para usar o algoritmo de Otsu 17 para detecção automática de estruturas do estroma. NOTA: Este é o mesmo algoritmo que é usado pela ferramenta de contacto e arredores. Usando o mesmo algoritmo de segmentação de imagem na análise automatizada da imagem gravada ea imagem simulado é fundamental a fim de manter os dados comparáveis. </li><li> Insira as configurações para células hematopoiéticas, que ARe simulado como formas circulares. NOTA: Os números de celulares para as células vermelhas, verdes e azuis estão diretamente carregado a partir do arquivo .csv (ver também o passo 5.6). <ol><li> Utilizar a ferramenta de simulação para calcular o diâmetro médio em px de células vermelhas, verdes e azuis. Para determinar a área média de uma única célula como a área total de cada tipo de célula na imagem em px dividido pela contagem total de células por imagem. Usar a área média para calcular o raio de um disco, utilizando a fórmula. Dobrar o raio para determinar o diâmetro médio. </li></ol></li><li> Medir a distribuição de tamanho de célula dos tipos celulares analisados ​​com o software de análise de imagem que inclui funções de segmentação de objectos. Determinar σ para todos os tipos de células hematopoiéticas (18 e Figura 5B). Observação: Uma vez que as distribuições de tamanho de célula das células gravadas não são determinadas pela análise de imagem automatizado, usar uma distribuição de Gauss, como uma aproximação das distribuições reais. A largura de tele curva de distribuição é descrita por σ e pode ser muito diferente para diferentes tipos de células. (Para mais detalhes, consulte a Figura 5B). <ol><li> A partir destas medições, determinar o &quot;tamanho de célula de corte&quot;: o diâmetro em que px descreve o menor objeto ainda reconhecido como uma célula completa pela ferramenta de análise de imagem. </li></ol></li><li> Digite os parâmetros nas respectivas caixas na interface gráfica do usuário (Figura 5A). <ol><li> Digite o tamanho da célula cortado, ou seja, o tamanho mínimo permitido celular na simulação, como um diâmetro em px. </li><li> Introduzir σ em px para a simulação da distribuição de tamanho de célula para as células vermelhas, verdes, azuis e (a partir do passo 5.9). </li><li> Marque a caixa &quot;Excluir&quot; na subseção &quot;Células em Mask&quot;. Com essa configuração, o programa escolheu uma nova posição para uma célula se confunde-se com pelo menos um pixel com uma área de no-go da máscara. Marque a caixa &quot;evitar a sobreposição celular? ̶1; na subseção &quot;exclusão Cell&quot;. </li><li> Introduza a distância mínima permitida entre os centros das duas células em px. NOTA: A distância mínima deve ser determinada a partir das imagens gravadas. Injustamente distâncias mínimas medidas conduzirão a resultados artificiais / tendenciosas para a comparação das imagens gravadas e simulados. </li><li> Definir a área máxima de sobreposição de 100%, se a sobreposição é definida pela distância mínima de centro a centro. </li><li> Defina a ferramenta de simulação para 1.000 repetições. </li><li> Marque a caixa &quot;células de salvamento automático?&quot; Para salvar as coordenadas dos objetos simulados para todas as repetições de cada imagem do lote como arquivos .rect (formato de texto). Marque a caixa &quot;imagens de salvamento automático?&quot; Para salvar um arquivo .tiff para cada imagem simulada. Digite uma tag comum para os arquivos salvos. NOTA: O &quot;? Células de salvamento automático&quot; opção reduz simulação executando tempo e tamanho total de dados, em comparação com quando salvar o real simulado images. Os arquivos .rect salvar as coordenadas das células simuladas como rectângulos e pode, assim, ser convertidos em imagens simuladas, se necessário. </li></ol></li><li> Inicie a simulação clicando em &quot;simulação Run&quot;. NOTA: A ferramenta de simulação gera automaticamente um arquivo .csv para os 1.000 simulações de cada imagem, incluindo as contagens de contacto média e contagens arredores de glóbulos vermelhos, verdes e azuis com as células vermelhas, verdes, azuis, e do estroma para cada conjunto de simulações repetidas . Além disso, para todos estes valores, as médias dos 1.000 simulações com desvio-padrão (STD) e erro padrão da média (SEM) são fornecidos. </li><li> Determinar a frequências de contacto e freqüências arredores de um conjunto de 1.000 imagens simuladas média. Para isso, divida o contato média e conta arredores pela contagem de células gravado por imagem. Comparar as frequências com os resultados da análise de co-localização automática da imagem gravada. </li><li> Aplicar stati adequadasmétodos stical dependendo da análise de 19 (para a Figura 7, foi utilizado um Wilcoxon bicaudal assinado teste de classificação). </li></ol>

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	<li>Kunisaki, Y., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secrets+of+the+bone+marrow+niche:+Enigmatic+niche+brings+challenge+for+HSC+expansion.">The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion.</a> Nat Med. 18, 864-865 (2012).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505, 327-334 (2014).</li><li>Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+niches+controlling+B+lymphocyte+behavior+within+bone+marrow+during+development.">Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development.</a> Immunity. 20, 707-718 (2004).</li><li>Cariappa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perisinusoidal+B+cells+in+the+bone+marrow+participate+in+T-independent+responses+to+blood-borne+microbes.">Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes.</a> Immunity. 23, 397-407 (2005).</li><li>Sapoznikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+clusters+of+dendritic+cells+provide+critical+survival+signals+to+B+cells+in+bone+marrow+niches.">Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches.</a> Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).</li><li>Tokoyoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Professional+memory+CD4++T+lymphocytes+preferentially+reside+and+rest+in+the+bone+marrow.">Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow.</a> Immunity. 30, 721-730 (2009).</li><li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+is+a+major+reservoir+and+site+of+recruitment+for+central+memory+CD8++T+cells.">Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells.</a> Immunity. 22, 259-270 (2005).</li><li>Lin, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+4-1BBL+on+radioresistant+cells+in+providing+survival+signals+through+4-1BB+expressed+on+CD8(+)+memory+T+cells+in+the+bone+marrow.">Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow.</a> Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).</li><li>Zehentmeier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+and+dynamic+components+synergize+to+form+a+stable+survival+niche+for+bone+marrow+plasma+cells.">Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells.</a> Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).</li><li>Nagasawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+niches+in+the+bone+marrow+required+for+B-cell+development.">Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development.</a> Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).</li><li>Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faithful+activation+of+an+extra-bright+red+fluorescent+protein+in+'knock-in'+Cre-reporter+mice+ideally+suited+for+lineage+tracing+studies.">Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in 'knock-in' Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies.</a> Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).</li><li>Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cre-transgenic+mouse+strain+for+the+ubiquitous+deletion+of+loxP-flanked+gene+segments+including+deletion+in+germ+cells.">A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells.</a> Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).</li><li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues,+whole-animals,+insects+and+plants.">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).</li><li>Kawamoto, T., Kawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+thin+frozen+sections+from+nonfixed+and+undecalcified+hard+tissues+using+Kawamot's+film+method.">Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method.</a> Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).</li><li>Smith, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+confocal+microscopy.">Basic confocal microscopy.</a> Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 2 (Unit 2.2), (2001).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">A threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).</li><li>Hughes, I., Hase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis. , (2010).</li><li>Quinn, G. P., Keough, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , (2002).</li><li>Kiel, M. J., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncertainty+in+the+niches+that+maintain+haematopoietic+stem+cells.">Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells.</a> Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).</li><li>MacQueen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Methods+for+classification+and+Analysis+of+Multivariate+Observations.">Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations.</a> Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. , 666 (1967).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Jarjour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+origin+and+dynamics+of+lymph+node+follicular+dendritic+cells.">Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells.</a> J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).</li><li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-cytometry:+a+method+for+highly+multiplex+quantitative+tissue+imaging+analysis+applied+to+dendritic+cell+subset+microanatomy+in+lymph+nodes.">Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes.</a> Immunity. 37, 364-376 (2012).</li><li>Moreau, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo.">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37, 351-363 (2012).</li><li>Siffrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+partially+reversible+th17+cell-induced+neuronal+dysfunction+in+the+course+of+encephalomyelitis.">In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis.</a> Immunity. 33, 424-436 (2010).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche:+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions.">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).</li><li>Danielsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euclidian+distance+mapping.">Euclidian distance mapping.</a> Computer Graphics and Image Processing. 14, 21 (1980).</li><li>Tellier, J., Kallies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+home+for+plasma+cells+-+a+niche+to+survive.">Finding a home for plasma cells - a niche to survive.</a> Eur J Immunol. , (2014).</li><li>Winter, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+constitute+a+functional+component+of+a+plasma+cell+niche+in+the+bone+marrow.">Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow.</a> Blood. 116, 1867-1875 (2010).</li><li>Rozanski, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+antibody+responses+depend+on+CD28+function+in+bone+marrow-resident+plasma+cells.">Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells.</a> J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).</li><li>Rodriguez Gomez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basophils+support+the+survival+of+plasma+cells+in+mice.">Basophils support the survival of plasma cells in mice.</a> J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homing+and+adhesion+patterns+determine+the+cellular+composition+of+the+bone+marrow+plasma+cell+niche.">Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche.</a> J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).</li><li>Kohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-CSF-mediated+thrombopoietin+release+triggers+neutrophil+motility+and+mobilization+from+bone+marrow+via+induction+of+Cxcr2+ligands.">G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands.</a> Blood. 117, 4349-4357 (2011).</li></ol>

Juan Escribano Navarro is affiliated with Wimasis GmbH, Munich, Germany. The other authors have no conflicts of interest to declare.

Apesar dos avanços nos métodos de imagem óptica modernos, a análise dos dados histológico ainda é muitas vezes dificultada pela falta de ferramentas adequadas e métodos de quantificação, ou por análises tendenciosas que se concentram em uma pequena área de interesse. A abordagem sinérgica aqui apresentada combina análise de imagem cobrindo toda a região de medula óssea, a segmentação automatizada e detecção de objectos de vários tipos de células hematopoiéticas e estromais, análise de co-localiza?...

Devido a recentes desenvolvimentos tecnológicos rápidos na microscopia, incluindo imageamento óptico, a análise de células dentro do contexto de todo o tecido tornou-se cada vez mais acessível para os imunologistas. A caracterização de células individuais em suspensão representa um método valioso e indispensável para compreender a função celular e molecular. No entanto, a análise das células dentro do seu (micro) -anatomical ambiente é essencial para a compreensão das interacções entre os vários tipos de células que colaboram com os processos complexos, tais como o desenvolvimento de respostas imunitárias. Embora seja relativamente fácil para os microscopistas para obter informações qualitativas a partir de imagens, continua a ser um desafio para quantificar esses dados, em parte devido ao fato de que os métodos de análise neste domínio estão ficando para trás em comparação com o que é possível na aquisição de imagem. Muitos pesquisadores ainda dependem de contagem manual de células em suas imagens de histologia demorado,introduzindo assim uma polarização entre diferentes avaliadores e impedindo a replicação por outros grupos. Muitas vezes, uma imagem representativa é escolhido para sublinhar uma declaração sobre a posição celular ou co-localização em uma publicação, tornando-se difícil para o leitor a julgar a relevância estatística de um evento como esse. Juntamente com o fato de que o conteúdo de informação completa de dados de imagem são raramente exploradas, que enfatiza a necessidade de uma abordagem mais imparcial, mais rápido e abrangente para analisar imagens histológicas. A medula óssea é um tecido complexo, que assume as funções vitais importantes como o órgão de hematopoiese em vertebrados adultos. Além de ser o local de nascimento de células hematopoiéticas 1,2 e desempenhando um papel importante no desenvolvimento de linfócitos B 3, ele também atua como um local onde as reações imunológicas são iniciados 4 e apoia, células de recirculação B maduras 5. Além disso, o seu papel na manutenção da imemória mmunological tornou-se cada vez mais apreciado na última década, como vários tipos de células que constituem a memória imunológica, foram encontrados para residir 6-9. A relação entre a arquitetura complexa do tecido da medula óssea e as suas funções ainda permanece elusiva. Ao contrário de órgãos linfóides secundários, que são organizadas em macro-compartimentos tais como zonas de células T e B, a medula óssea não tem uma macro-compartimentalização clara. Até agora compartimentos distintos na medula óssea são definidos, pela sua proximidade ao córtex do osso ou a vasculatura. A importância das várias populações de células do estroma residentes na medula óssea para um número de processos tais como células estaminais, que suportam o desenvolvimento de células B ou a manutenção de populações de células de memória imunes (tais como células plasmáticas durabilidade (PCs), CD4 + e CD8 +, células T da memória) indica claramente que existe um certo grau de micro-compartimentalização na medula óssea. <pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; Estas observações levaram ao conceito de nichos microanatômico distintas, que são especializados em certas funcionalidades (manutenção de células estaminais, o desenvolvimento de células B em várias fases, e manutenção de memória imunológica) na medula óssea. Embora pareça haver um certo grau de heterogeneidade entre os nichos que servem funções diferentes, alguns dos factores produzidos pelas células estromais, tais como ligando de quimiocina CXC-12 (CXCL12) ou a interleucina 7 (IL-7), são componentes cruciais para vários desses nichos 10. A visualização e caracterização de células do estroma da medula óssea é difícil devido às suas características morfológicas, com extensões dendríticas longos e finos formando uma rede em toda a medula óssea, e a falta de marcadores apropriados para discriminar subpopulações estromais. Ainda não está claro até que ponto esses nichos partilham características comuns em relação à sua compositio celular e molecularn, e que elementos tornar um determinado nicho único. Para além das células do estroma, os tipos de células hematopoiéticas tenham sido mostrado desempenhar um papel crucial, fornecendo certos sinais de, pelo menos, para alguns dos nichos. Claramente, a complexidade da composição nicho requer sua análise in situ, e tornou-se cada vez mais importante para imunologistas e hematologistas para aumentar o zoom na microarquitetura de medula óssea, por exemplo, analisando as relações espaciais entre seus componentes celulares. Aqui, uma estratégia para quantificar co-localização e de vizinhança relações celulares na medula óssea de uma forma automática e imparcial é apresentado. Um fluxo de trabalho detalhadas, incluindo a geração de camundongos quiméricos, que abriga as células fluorescentes estromais e células hematopoiéticas não fluorescentes, preparação de cortes histológicos de ossos não descalcificadas, aquisição de imagens confocal que cobrem o osso inteiro, bem como a análise de imagem automatizado de c celularo-localização e a sua validação / discriminação de posicionamento aleatório por uma ferramenta de simulação é fornecida (Figura 8).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1864">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:1200px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Neomycin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">N6386 SIGMA</td>
			<td>Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">Ursovit AD3EC</td>
			<td style="width:145px;">Serumwerke Bernburg</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate,&#160; 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">P4333&#160;&#160; Sigma&#160;&#160;&#160;&#160; H3375&#160;&#160; Sigma&#160;&#160;</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin)</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg</td>
			<td style="width:145px;">Rockland</td>
			<td style="width:155px;">D602-0100</td>
			<td>www.rockland-inc.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade)</td>
			<td style="width:145px;">Science Services</td>
			<td style="width:155px;">15713</td>
			<td>EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">D(+)-Sucrose</td>
			<td style="width:145px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:155px;">4621.1</td>
			<td>www.carlroth.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Dry ice</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">Acetone</td>
			<td style="width:145px;">Sigma.Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">179124 SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">Hexane</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">208752 SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Tissue-Tek cryomolds (standard)</td>
			<td style="width:145px;">Sakura&#160;</td>
			<td style="width:155px;">4557</td>
			<td>25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td style="width:145px;">Sakura&#160;</td>
			<td style="width:155px;">4583</td>
			<td>&#160;www.sakuraus.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Kawamoto&#39;s SCEM embedding medium</td>
			<td style="width:145px;">Section-Lab, JP</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>http://section-lab.jp/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Kawamoto&#39;s cryosection preparation kit&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Section-Lab, JP</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>http://section-lab.jp/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Kawamoto&#39;s cryofilm type 2C(9)</td>
			<td style="width:145px;">Section-Lab, JP</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>http://section-lab.jp/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:155px;">3052835</td>
			<td>L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13&#34;), thickness: 0.25 mm (0.01&#34;);www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated</td>
			<td style="width:145px;">Rockland</td>
			<td style="width:155px;">600-406-379</td>
			<td>www.rockland-inc.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Alexa Fluor 555 streptavidin</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:155px;">S-32355</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">rat anti-MBP</td>
			<td style="width:145px;">J. and N. Lee</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">goat anti-rat-Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:155px;">A-21247</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">rat anti-B220 - Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">mouse anti-l1 light chain -FITC</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">rat anti-k light chain - FITC</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">D9542 SIGMA</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Fluorescent mounting medium</td>
			<td style="width:145px;">DAKO</td>
			<td style="width:155px;">S3023</td>
			<td>www.dako.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm)</td>
			<td style="width:145px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:155px;">H875.2</td>
			<td>www.carlroth.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm)</td>
			<td style="width:145px;">VWR</td>
			<td style="width:155px;">48311-703</td>
			<td>www.vwr.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Laser scanning confocal microscope&#160;</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Automated image analysis tools for bone marrow</td>
			<td style="width:145px;">Wimasis, Munich</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VC2012 Runtime</td>
			<td style="width:145px;">Microsoft</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Simulation tool for random cell positioning</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>available from us, upon request</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:365px;">Image analysis software with image segmentation functions</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org)&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Fiji image analysis software&#160;</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated quantification of hematopoietic cell &#8211; stromal cell interactions in histological images of undecalcified bone

A microscopia confocal é o método de escolha para a análise da localização de vários tipos de células presentes nos tecidos complexos, tais como a medula óssea. No entanto, a análise e quantificação de localização celular é difícil, já que em muitos casos, depende de contagem manual, tendo, assim, o risco de introduzir um viés dependente avaliadores e reduzindo a confiabilidade entre examinadores. Além disso, muitas vezes é difícil avaliar se a co-localização entre duas células resulta de posicionamento aleatório, especialmente quando tipos de células diferem fortemente da frequência de sua ocorrência. Aqui, um método para a quantificação isenta de co-localização celular na medula óssea é introduzido. O protocolo descreve a preparação da amostra para se obter secções histológicas de ossos longos de murino inteiros, incluindo a medula óssea, bem como o protocolo de coloração e a aquisição de imagens de alta-resolução. Um fluxo de trabalho de análise que vai desde o reconhecimento da hematopoiética e não hemattipos de células opoietic em 2 dimensões imagens de medula (2D) osso para a quantificação dos contactos directos entre as células é apresentado. Isto também inclui uma análise de vizinhança, para se obter informações sobre o microambiente celular em torno de um determinado tipo de célula. A fim de avaliar se a co-localização dos dois tipos de células é a mera função do posicionamento de célula ou aleatório reflecte associações preferenciais entre as células, uma ferramenta de simulação, que é adequado para testar esta hipótese, no caso de células hematopoiéticas, assim como as células do estroma, é utilizado. Esta abordagem não é limitada para a medula óssea, e pode ser alargado a outros tecidos para permitir a análise reprodutível, quantitativa dos dados histológicos.

Cortando criocortes de osso descalcificada com o método de Kawamoto fita permite que todo o osso a ser cortado como uma secção intacta, com a medula óssea da região endosteal ainda ligado ao osso mineralizado, tanto na diáfise, bem como nas áreas da epífise com a sua alta densidade do osso trabecular (Figura 1). A coloração nuclear das secções revela que, apesar de pequenas fendas na preparação não pode ser totalmente evitado, a estrutura das artérias e sinusóides, bem como a rede retic...

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Automated Quantification of Hematopoietic Cell &amp;#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Automated Quantificação de células hematopoiéticas - Interações de células estromais em imagens histológicas de osso não descalcificadas

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

automated-quantification-hematopoietic-cell-stromal-cell-interactions

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

11.4K visualizações.  German Rheumatism Research Center, a Leibniz Institute. A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

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Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce mutations that potentially lead to cancer. The use of an enzymatic assay to quantify stem cell mutations in the X-linked glucose-6-phosphate dehydrogenase gene has been previously reported.1 This method requires the preparation of frozen sections and incubation of the sectioned tissue with a reaction mixture that yields a blue color if the cells produce functional glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) enzyme. If not, the cells appear whitish. We have modified the reaction mixture using Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) medium in place of polyvinyl alcohol. This facilitates pH measurement, increases solubilization of the G6PD staining components and restricts diffusion of the G6PD enzyme. To demonstrate that a mutation occurred in a stem cell, the entire crypt must lack G6PD enzymatic activity. Only if a stem cell harbors a phenotypic G6PD mutation will all of the progeny in the crypt lack G6PD enzymatic activity. To identify crypts with a stem cell mutation, four consecutive adjacent frozen sections (a level) were cut at 7 &#181;m thicknesses. This approach of making adjacent cuts provides conformation that a crypt was fully mutated since the same mutated crypt will be observed in adjacent sections. Slides with tissue samples that were more than 50 &#181;m apart were prepared to assess a total of &#62;104 crypts per mouse. The mutation frequency is the number of observed mutated (white) crypts &#247; by the number of wild type (blue) crypts in a treatment group.

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Quantificação de mutações de células-tronco do cólon

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

Biologia do Desenvolvimento

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.

This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.

Transplantes competitivos para avaliar hematopoéticas aptidão Stem Cell

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Ordenação temporal de Expressão Dynamic Data de expressão espacial mapas detalhados

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolamento e Caracterização de células mesenquimais do estroma a partir de cordão umbilical humano e Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Uma nova técnica de transplante de almofada de gordura mamária para visualizar a geração de vasos de células vasculares endoteliais vasculares

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioengenharia de microrganismos humanizados de medula óssea no mouse e sua visualização por imagem ao vivo

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide suffering from corneal vision loss1. To address the demand for viable human corneas, significant progress in three-dimensional (3D) tissue engineering has been made2,3,4. These cornea models range from simple monolayer systems to multilayered models, leading to 3D full-thickness corneal equivalents2.
However, the use of a 3D tissue-engineered cornea in the context of in vitro disease models studied to date lacks resemblance to the multilayered 3D corneal tissue structure, function, and the networking of different cell types (i.e., nerve, epithelium, stroma, and endothelium)2,3. In addition, the demand for in vitro cornea tissue models has increased in an attempt to reduce animal testing for pharmaceutical products. Thus, more sophisticated models are required to better match systems to human physiological requirements, and the development of a model that is more relevant to the patient population is absolutely necessary. Given that multiple cell types in the cornea are affected by diseases and dystrophies, such as Keratoconus, Diabetic Keratopathy, and Fuchs, this model includes a 3D co-culture model of primary human corneal fibroblasts (HCFs) from healthy donors and neurons from the SH-SY5Y cell line. This allows us for the first time to investigate the interactions between the two cell types within the human corneal tissue. We believe that this model could potentially dissect the underlying mechanisms associated with the stromal-nerve interactions of corneal diseases that exhibit nerve damages. This 3D model mirrors the basic anatomical and physiological nature of the corneal tissue in vivo and can be used in the future as a tool for investigating corneal defects as well as screening the efficacy of various agents before animal testing.

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

This protocol describes a novel three-dimensional in vitro model, where corneal stromal cells and differentiated neuronal cells are cultured together to assist in the examination and understanding of the interactions of the two cell types.

Engenharia de tecido corneal: Um em Vitro modelo das interações nervo-estromal da córnea humana

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

Um baseado em RANKL Osteoclast cultura ensaio de Mouse medula óssea para investigar o papel de mTORC1 na formação de Osteoclast

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used approaches to determine protein half-life are either limited to population averages from lysed cells or require the use of protein synthesis inhibitors. This protocol describes a method to measure protein half-lives in single living adherent cells, using SNAP-tag fusion proteins in combination with fluorescence time-lapse microscopy. Any protein of interest fused to a SNAP-tag can be covalently bound by a fluorescent, cell permeable dye that is coupled to a benzylguanine derivative, and the decay of the labeled protein population can be monitored after washout of the residual dye. Subsequent cell tracking and quantification of the integrated fluorescence intensity over time results in an exponential decay curve for each tracked cell, allowing for determining protein degradation rates in single cells by curve fitting. This method provides an estimate for the heterogeneity of half-lives in a population of cultured cells, which cannot easily be assessed by other methods. The approach presented here is applicable to any type of cultured adherent cells expressing a protein of interest fused to a SNAP-tag. Here we use mouse embryonic stem (ES) cells grown on E-cadherin-coated cell culture plates to illustrate how single cell degradation rates of proteins with a broad range of half-lives can be determined.

This protocol describes a method to determine protein half-lives in single living adherent cells, using pulse labeling and fluorescence time-lapse imaging of SNAP-tag fusion proteins.

Célula única quantificação das taxas de degradação de proteínas por microscopia de fluorescência de lapso de tempo em cultura de células aderentes

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...