Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da epigenômica, demonstrando como projetar e implementar uma ferramenta baseada em sequenciamento para avaliar o impacto de fatores ambientais na metilação do DNA. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode fornecer um método mais abrangente e quantitativo para avaliar os níveis de metilação de DNA em comparação com plataformas baseadas em array. As implicações dessa técnica se estendem para a identificação de alterações de metilação de DNA devido a diferentes tipos de processos fisiológicos em qualquer organismo cujos dados sequenciais estão disponíveis.
Embora este método possa fornecer uma visão do impacto do estresse na metilação do DNA, ele também pode ser aplicado a outros fatores ambientais ou condições fisiológicas, como a exposição a tóxicos ambientais em dieta rica em gordura e condições como diabetes e doenças cardiovasculares. Depois de cortar DNA e verificar o tamanho via bioanalíquio, adicione 180 microliters de contas magnéticas de ligação de DNA a cada amostra, e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Pellule as contas em uma placa magnética, e remova o supernatante.
Resuspense a pelota em 200 microliters de 70% de etanol. Em seguida, use uma placa magnética para pelotar as contas, e remova o máximo de etanol possível. Seque as contas em um bloco de calor a 37 graus Celsius por três a cinco minutos.
Em seguida, resuspenja a pelota em 44 microliters de água sem nuclease, e colete aproximadamente 42 microliters do supernatante. Depois de ligar os adaptadores e verificar a ligadura via bioanalífero, transfira as amostras para tubos de microcentrifuge de baixa ligação de DNA. Em seguida, use um concentrador de vácuo aquecido para reduzir o volume amostral abaixo de 3,4 microliters.
Depois disso, adicione 5,6 microliters de Metil-Seq Block Mix a cada amostra e incuba-os em um cicloviário térmico. Prepare o Mix de Hibridização da Biblioteca de Captura de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, adicione 20 microliters de Capture Library Hybridization Mix a cada amostra, e incubar a 65 graus Celsius por 16 horas.
No final do período de incubação, prepare contas magnéticas streptavidin adicionando 50 microliters de contas magnéticas streptavidin por amostra a um novo tubo de tira de oito poços. Lave as contas com 200 microliters de Tampão de Ligação Metil-Seq. Coloque o tubo de tira em uma placa magnética e remova o sobrenatante das contas.
Em seguida, resuspenja as contas em 200 microliters de Tampão de Ligação Metil-Seq. Adicione as amostras às contas de streptavidina lavadas e incuba-as à temperatura ambiente por 30 minutos em uma batedeira rotativa. Enquanto as amostras se misturam, aliquot 200 microliters de Methyl-Seq Wash Buffer Dois em poços triplicados de uma placa de 96 poços e pré-quente a 65 graus Celsius.
Após a incubação das amostras, pelota as contas magnéticas com uma placa magnética e remova o sobrenante. Em seguida, resuspenja as contas em 200 microliters de Methyl-Seq Wash Buffer One. Incubar as contas por 15 minutos em temperatura ambiente e usar uma placa magnética para remover o sobrenatante.
Depois disso, resuspenque a pelota de contas em 200 microliters de buffer de lavagem pré-aquecido Dois. Em seguida, incubar as contas em um cicloviário térmico antes de usar uma placa magnética para pelotar as contas. Adicione 20 microlitadores de Amortecedor de Eluição Metil-Seq às contas lavadas e incuba-as à temperatura ambiente por 20 minutos.
Use uma placa magnética para pelotar as contas, e transfira o supernatante para um novo tubo de tira. Primeiro, adicione 130 microliters de reagente de conversão de bisullfita ao supernanato coletado anteriormente. Divida as reações de 150 microliter igualmente em dois poços.
Em seguida, incubar as reações em um cicloviário térmico. Use 600 microliters de Buffer de Ligação para ligar as amostras às colunas de giro e lavar as colunas com 100 microliters de Wash Buffer. Em seguida, centrifufique as colunas e descarte o fluxo.
Depois disso, adicione 200 microliters de Tampão de Dessulphonação às colunas. Incubar as colunas por 15 a 20 minutos em temperatura ambiente. Lave as colunas duas vezes com 200 microliters de Wash Buffer.
Em seguida, adicione 10 microliters de Amortecedor de Elução à coluna. Incubar à temperatura ambiente e centrífuga. Prepare a mistura mestre de reação pcr de acordo com o protocolo de texto.
Em seguida, adicione 82 microliters da mistura mestre a cada amostra, e incubar as amostras em um cicloviário térmico. Primeiro, prepare o PCR Master Mix Two no gelo de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, a cada amostra, adicione 25,5 microlitros de PCR Master Mix Dois e cinco microlitros de primers de indexação comercial, e incubar as amostras em um cicloviário térmico.
Avalie a concentração de DNA das amostras com reagentes de detecção de DNA de alta sensibilidade em um bioanalílise. As bibliotecas Metil-Seq são então submetidas para sequenciamento no sequenciador de próxima geração. Após a conversão de bisulfato e amostras de validação amplificadoras de PCR, prepare uma mistura mestre com tampão de ligação, água e contas de sepharose revestidas de streptavidin.
Em seguida, adicione 75 microliters da mistura mestre e cinco microliters do produto PCR aninhado a uma placa de 96 poços, e agite a placa em um agitador de placa por 15 a 60 minutos. Enquanto a placa treme, adicione 12 microliters de primer aos poços de uma placa de ensaio de pyrosequencing. Depois de tremer, coloque uma ferramenta de vácuo em um cocho cheio de água e, em seguida, coloque a ferramenta na placa com reações de encadernação.
Em seguida, submergir a ferramenta de vácuo em calhas semi-preenchidas contendo 70% de etanol, hidróxido de sódio e tampão tris-acetato. Desconecte o vácuo e coloque a ferramenta de vácuo na placa de ensaio de pyrosequencing HS para transferir as contas. Coloque a placa em um bloco de calor e incubar a 80 graus Celsius por dois minutos.
Por fim, deixe a placa esfriar por cinco minutos antes de iniciar o programa piro. Neste protocolo, a análise das bibliotecas de Metil-Seq forneceu uma lista ranqueada de regiões diferencialmente metiladas, ou DMRs, entre animais estressados e não estressados e um enredo gráfico das DMRs. A validação via pirosequenciamento bisulfita mostrou que todos os animais estressados apresentaram níveis de metilação mais elevados em todos os CpGs do que os animais não estressados.
Os níveis de metilação no CpG 10 também foram comparados com os níveis médios de CORT de três semanas para cada animal. Os resultados indicam que há uma correlação modesta entre os dados endócrinos e de metilação. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de comparar o aumento do tamanho médio do DNA entre as etapas de corte de DNA e ligadura do adaptador e garantir quantidade suficiente de biblioteca antes do sequenciamento.
Após esse procedimento, outras abordagens semelhantes podem ser implementadas para responder a novas questões, como o impacto dos toxicantes ambientais no neurodesenvolvimento de ratos. Após seu desenvolvimento, essa técnica forneceu os meios para pesquisadores no campo da epigenética explorarem alterações de metilação de DNA em todo o genoma em qualquer organismo não-modelo ou modelo onde sequências genômicas estão disponíveis. Não se esqueça que trabalhar com as enzimas sensíveis à temperatura requer armazenamento no gelo enquanto estiver em uso e armazenamento no congelador de menos 20 graus.
As contas de RNA usadas para captura de alvo requerem descongelamento e armazenamento no gelo enquanto estão em uso e armazenamento a longo prazo no congelador de menos 80 graus.
