Devido à sua alta eficiência, este método pode avançar ainda mais células-tronco pluripotentes induzidas, ou IPSCs como uma ferramenta para estudar doenças humanas e desenvolver novas terapias com células-tronco. A principal vantagem deste protocolo é a capacidade de gerar IPSCs livres de integração de alta qualidade a partir de fibroblastos humanos primários, incluindo fibroblastos difíceis de reprogramar, associados a doenças, idosos e senescentes. O sucesso deste método depende da ótima eficiência de transfecção do RNA dos fibroblastos.
E ajustar o pH de um buffer de transfecção é um procedimento fundamental para conseguir isso. Para começar, prepare o tampão de transfecção usando 500 mililitros e 100 mililitros de temperatura ambiente pré-aquecidos garrafas de meio soro reduzido fresco. Meça o pH base do meio em garrafa de 500 mililitros inserindo o eletrodo de vidro do medidor de pH no buffer e espere até um minuto antes de ler o pH.
Para ajustar o pH, adicione três a quatro mililitros de um hidróxido de sódio molar em uma garrafa de 500 mililitros. Feche a garrafa e misture bem. Depois de esperar por cinco minutos, abra a garrafa e insira o eletrodo do medidor de pH no tampão.
Aguarde até que a leitura no medidor de pH estabilize. Continue adicionando pequenos volumes de um hidróxido de sódio molar até que o pH atinja 8,15 a 8,17, certificando-se de calibrar o medidor de pH várias vezes durante o processo. Use um sistema de filtragem de vácuo de 0,22 micrômetro para filtrar a esterilização do tampão de transfecção.
Aliquot o tampão esterilizado em tubos de cinco mililitros com espaço mínimo de ar. Verifique se os fibroblastos a serem reprogramados estão entre 40% e 60%. Transfira quatro mililitros de DPBS em um tubo cônico de 15 mililitros, e adicione 100 microliters de laminina humana recombinante 521.
Misture bem por pipetting para cima e para baixo. Adicione um mililitro por poço de laminina humana recombinante diluída 521 em três poços de uma placa de seis poços. Incubar esta placa revestida a 37 graus celsius por duas horas.
Durante esta incubação, aquecem seis mililitros de expansão do fibroblasto médio e quatro mililitros de revestimento médio a 37 graus celsius. Suplemente o meio de revestimento com FGF básico em uma concentração final de 100 nanogramas por mililitro e B18R em uma concentração final de 200 nanogramas por mililitro. Aspire cuidadosamente o meio gasto de fibroblastos que estão em 40% a 60% de confluência.
Enxágüe as células com cinco mililitros de DPBS. Adicione três mililitros de trippsina EDTA e balance suavemente a placa para cobrir as células com trippsina EDTA. Aspirar o excesso de fluido, deixando aproximadamente 500 microliters de trippsina, e incubar os fibroblastos por três minutos a 37 graus celsius.
Depois de remover a placa da incubadora, toque com firmeza, mas cuidadosamente na lateral da placa para desalojar as células. Veja as células sob o microscópio para verificar se elas foram separadas. Adicione cinco mililitros de meio de expansão do fibroblasto às células separadas para neutralizar a trippsina EDTA.
Colete as células em um tubo cônico de 15 mililitros e misture-as bem. Conte as células usando um hemótmetro, depois pipeta 12.000 células em quatro mililitros de meio de revestimento pré-aquecido previamente preparado. Depois de remover a placa revestida da incubadora, aspirar laminina diluída 521 dos poços, certificando-se de que a superfície dos poços não seque.
Levemente resuspenque as células que estão no meio de chapeamento e adicione um mililitro de suspensão celular em cada poço revestido. Coloque as células banhadas em uma incubadora de cultura de tecido de três gases com baixo oxigênio ou oxigênio definido para 5% E, em seguida, disperse suavemente, mas completamente, as células alternando entre um movimento para baixo, em seguida, movimento esquerdo direito, e repetir os movimentos mais duas vezes, certificando-se de não girar a placa. Incubar as células durante a noite.
Enquanto isso, adicione quatro mililitros de meio de reprogramação a um tubo cônico de 15 mililitros, e coloque-o na incubadora baixa O dois com uma tampa solta para equilibrar durante a noite. Pelo menos uma hora antes da transfecção, remova o meio de reprogramação equilibrado de uma incubadora baixa O 2. Adicione bFGF a uma concentração final de 100 nanogramas por mililitro, e B18R a uma concentração final de 200 nanogramas por mililitro, e misture bem.
Trabalhando um bem de cada vez, use uma pipeta de um mililitro para remover o meio gasto. E substituí-lo por um mililitro de meio de reprogramação, complementado com bFGF e B18R. Mova a placa com células de volta para a incubadora de baixo oxigênio.
Para iniciar a transfecção do fibroblasto, primeiro equilibre uma alíquota do tampão de transfecção por aproximadamente uma hora à temperatura ambiente. Remova uma única alíquota de 33 microliter de MRNAs modificadas e 14 alíquotas microliter de mímicas MIRNA de 80 graus celsius negativos, e aqueça-as à temperatura ambiente por aproximadamente três a cinco minutos até descongelar. Gire-os brevemente em um microfuge.
Aqueça o reagente de transfecção à temperatura ambiente por aproximadamente três a cinco minutos. Inverta o tubo duas a três vezes para misturar o reagente e gire-o brevemente em um microfuge. Transfira 279 microliters do tampão de transfecção de temperatura ambiente em um tubo de microcentrifuuge livre de RNAs e adicione 31 microliters do reagente de transfecção.
Misture bem por pipetar e incubar à temperatura ambiente por um minuto. Adicione 132 microliters do tampão de transfecção de temperatura ambiente à alíquota de 33 microliteres de MRNA modificada e pipeta suavemente para misturar. Adicione 102,6 microliters do tampão de transfecção de temperatura ambiente à alíquota de 14 microliteres de imitações MIRNA e pipeta suavemente para misturar.
Para preparar a mistura de transfecção de MRNA modificada, adicione 165 microliters do tampão de transfecção de 310 microliters, mistura de reagente transfeccionado a 165 microliters do tampão de transfecção, mistura MRNA modificada. Pipeta para misturar. Para preparar a mistura de transfecção das mímicas MIRNA, adicione 116,6 microliters do tampão de transfecção de 310 microliteres, mistura de reagente de transfecção ao tampão de transfecção de 116,6 microliteres, mistura de imitação MIRNA.
Misture bem e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente para permitir que o tampão de transfecção se ensisse com as MAMHs modificadas e as Mímicas MIRNA modificadas. Remova a placa com células da incubadora de baixo oxigênio. Solte-se sábio em cada poço, adicione 100 microliters por poço da mistura de transfecção contendo os MRNAs complexos e modificados.
Agitar suavemente, mas cuidadosamente a placa com um movimento para baixo, em seguida, esquerda direita para dispersar os complexos de transfecção. Adicione 66,7 microliters por poço da mistura de transfecção contendo as mímicas MIRNA complexas que caem sábias em cada poço. Agitar suavemente, mas cuidadosamente a placa com um movimento para baixo, em seguida, esquerda direita para dispersar os complexos de transfecção.
Coloque a placa com as células transfeinadas na incubadora de três gases com baixo oxigênio. Disperse os complexos de transfecção suavemente, mas completamente agitando a placa com um movimento para baixo e, em seguida, para a direita esquerda. Incubar as células transfeinadas na incubadora por 16 a 20 horas antes de mudar o meio no dia seguinte.
Adicione quatro mililitros de meio de reprogramação a um tubo cônico de 15 mililitros, e coloque-o na incubadora baixa O dois com uma tampa solta para equilibrar durante a noite. Na manhã seguinte, substitua a transfecção contendo meio pelo meio pré-equilibrado fresco complementado com bFGF e B18R e continue com o regime de transfecção conforme descrito no protocolo. Depois de um bom sucesso em um poço de seis pratos bem forma formato para reprogramação, os fibroblastos pareciam muito escassos.
24 horas após a primeira transfecção bem sucedida, os fibroblastos perderam a forma do fuso e adotaram uma morfologia mais arredondada. Ao longo das três primeiras transfecções, a densidade celular aumentou gradual e consistentemente com uma aparente explosão de proliferação ocorrendo entre os dias sete e oito. No dia 10, as células pareciam em grande parte confluentes.
As primeiras colônias ipsc apareceram logo no dia 11. Nos dias 15 a 17, as colônias ipsc tornaram-se grandes e óbvias e claramente distintas dos fibroblastos circundantes e completamente reprogramados. Imunostaining para o marcador de pluripotência TRA-1-60 confirmou alta eficiência de reprogramação.
A densidade de revestimento subótimo é a razão mais comum para a redução da eficiência da reprogramação neste protocolo. Se a densidade de revestimento era muito baixa, grandes manchas de barão acelular apareceram e as colônias IPSC não se formaram. Após a passagem de diluição de células reprogramadas, os IPSCs cresceram como colônias únicas e foram facilmente distinguíveis dos fibroblastos.
Eles estavam vagamente embalados e as células individuais tinham uma área citoplasmática relativamente grande. Ao longo de quatro a sete dias, os IPSCs proliferaram e formaram uma colônia bem embalada com bordas definidas. Células individuais dentro da colônia mostraram uma grande fração nuclear com nucleoli proeminente.
Após a reprogramação dos fibroblastos dos pacientes, os IPSCs resultantes podem ser diferenciados em uma variedade de células somáticas, a fim de elucidar doenças que causam mecanismos ou desenvolver novas terapêuticas baseadas em células regenerativas.
