As telas de desistência com tela CRISPR fornecem aos pesquisadores um método simples, eficiente e barato para interrogar a função em cadeia no nível de genoma. A vantagem do CRISPR é sua capacidade de editar qualquer gene simplesmente alterando a sequência guia. As bibliotecas guias crispr permitem que os pesquisadores interroguem todo o genoma de qualquer organismo em um experimento de forma imparcial e sistemática.
Atualmente, as telas CRISPR estão sendo usadas para identificar genes essenciais em centenas de cânceres humanos e mapear interações genéticas. As telas também podem traçar o perfil abrangente de drogas para revelar mecanismos de ação de drogas. As bibliotecas CRISPR descritas aqui têm como alvo células humanas.
No entanto, bibliotecas guias voltadas para outras espécies, como o mouse, estão disponíveis e podem ser rastreadas da mesma forma. A realização de telas em todo o genoma em células humanas pode ser assustadora na prática, pois envolve o manuseio de dezenas de milhões em células e requer a análise de grandes conjuntos de dados. Antes de iniciar uma tela, certifique-se de que as linhas de celular são cuidadosamente caracterizadas.
Isso inclui conhecer a pureza da sua linha celular, dobrar o tempo, eficiências de transdução de lentivírus e sensibilidades aos agentes de seleção de antibióticos. Uma demonstração visual fornecerá uma imagem de como praticamente lidar com os milhões de células necessárias em uma tela e acompanhar milhares de perturbações de forma sistemática. Demonstrando o procedimento estarão Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh e Ryan Climie, todos técnicos do meu laboratório.
Comece transformando o plasmídeo de sgRNA crispr pronto em células eletrocompetntes e crescendo-as de acordo com as instruções do manuscrito. Quando estiver pronto para colher as colônias, adicione sete mililitros de LB com carbenicilina em cada placa e raspe as colônias com o espalhador de células. Use uma pipeta de 10 mililitros para transferir as células raspadas em um frasco cônico estéril de um litro e enxágue a placa com cinco mililitros de LB com carbenicilina.
Novamente, transfira a solução de lavagem para o frasco. Centrifugar as células de acordo com as instruções do manuscrito, e então, determinar o peso da pelota molhada. Purifique o DNA plasmídeo usando um kit de purificação plasmídeo maxi ou mega.
Prepare as células para transfecção semeando 293 células T e incubando-as durante a noite. No dia seguinte, prepare a mistura de três plasmídeos de transfecção para placas de 15 centímetros. Calcule a quantidade de plasmídeo necessário para uma transfecção e faça uma mistura de plasmídeos para que o número de placas, mais uma, seja transfeccionada.
Em seguida, prepare um reagente de transfecção à base de lipídio para cada transfecção e mídia de soro reduzida por aliquot em tubos individuais de microcentrífuga de 1,5 mililitro para o número de placas a serem transfecidas. Adicione o reagente de transfecção, misture delicadamente e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Após a incubação, adicione DNA ao reagente de transfecção em uma proporção de três para um reagente de transfecção para microgramas do complexo de DNA.
Misture a solução suavemente e deixe em temperatura ambiente por 30 minutos. Adicione a mistura de transfecção às células de embalagem e incuba-as de acordo com as instruções do manuscrito. No dia da colheita viral, verifique as células quanto à morfologia anormal e fundida como uma indicação de boa produção de vírus, e colmeia o lentivírus coletando o supernante e transferindo-o para um tubo de centrífuga estéril.
Comece selecionando a cobertura da biblioteca do guia CRISPR RNA para ser mantida em toda a tela. Com base na cobertura da biblioteca, determine o número de células necessárias para mantê-la por guia RNA e o número de células necessárias para infecção no MOI 0.3. Em seguida, determine o número de placas necessárias para configurar a infecção e, em seguida, colher e semear as células em cada placa.
Adicione brometo de hexadimethrina a todas as placas e adicione o volume necessário de vírus para triagem e controle de duas placas. Não adicione vírus para controlar um. Substitua esse volume por mídia.
Misture bem as placas inclinando e coloque as placas em uma incubadora, certificando-se de que elas estão niveladas. Colher células infectadas de acordo com as instruções do manuscrito e coletar três réplicas de pelotas celulares das células agrupadas para extração genômica de DNA. Centrifugar as células a 500 vezes g durante cinco minutos e lavá-las com PBS.
Rotule os tubos e congele as pelotas celulares a menos 80 graus Celsius. Divida o pool de células infectadas em três grupos de replicação, certificando-se de manter a cobertura da biblioteca dentro de cada réplica. Semear as células a uma densidade que normalmente seria usada ao expandi-las.
Use o mesmo número de células para cada réplica e o mesmo número total de células entre as réplicas. Continue a passagem das células e colher três réplicas de pelotas celulares de cada réplica de células infectadas agrupadas para até 15 a 20 duplicações celulares. Em cada passagem, colhe as células de todas as placas em cada réplica entre si.
Rotule cada pelota com o tempo e replique a designação. Configure o PCR1 de acordo com as instruções do manuscrito com um total de 100 microgramas de DNA genômico a 3,5 microgramas de DNA genômico por reação de 50 microliteras e configure reações idênticas de 50 microliteras para alcançar a cobertura desejada. Configure uma reação do tubo PCR de acordo com as instruções do manuscrito.
Use cinco microliters do produto PCR1 agrupado como modelo e use combinações de primer de índice exclusivas para cada amostra individual para permitir o agrupamento de amostras de biblioteca de sequenciamento. Depois de completar o PCR, execute o produto do tubo PCR em um gel de 2% de agarose em baixa tensão por uma a 1 1/2 horas. Visualize o produto em um transilluminador de luz azul e extireta a banda de 200 pares base.
Purificar o DNA e medir sua quantidade e qualidade com um espectotógrafo e um fluorômetro. Uma biblioteca RNA guia ideal deve ter cada guia RNA representado em quantidades semelhantes. O sequenciamento da próxima geração pode ser usado para confirmar que a biblioteca tem uma distribuição apertada de RNAs guia.
A análise de recall de precisão pode ser usada para avaliar o desempenho da tela. Uma tela de alto desempenho deve recuperar um grande número de genes essenciais em um fator base maior que seis e uma falsa taxa de descoberta inferior a 5% A curva de retirada de precisão deve ter um cotovelo afiado e uma linha reta até o ponto terminal. O fator Bayes representa uma medida de confiança que o nocaute genético resulta em um defeito de aptidão.
Pontuações altas indicam aumento da confiança, enquanto pontuações baixas sugerem que o nocaute genético oferece vantagens de crescimento. Piscinas de nocaute em todo o genoma podem ser cultivadas na presença de agentes de drogas em excesso para procurar genes de resistência supressora. Para realizar uma tela de seleção positiva para supressor do bloco de timmidina, as contagens de leitura normalizadas para todos os RNAs guiados no T0 são plotadas contra contagens de leituras normalizadas para amostras tratadas com timmidina.
Um detalhe fundamental para a realização com sucesso de telas CRISPR é manter uma boa distribuição de cada RNA guia, desde a transfecção do plasmídeo até a transdução de células. Isso minimizará a chance de efeitos aleatórios que podem distorcer a representação do RNA e levar a resultados falsos positivos ou negativos. Após uma validação da tela, os experimentos devem ser feitos para confirmar os hits porque a tela principal só identifica possíveis acertos.
Dependendo da biologia dos hits, vários métodos podem ser usados. A edição crispr, combinada com o sequenciamento de próxima geração, permitiu a perda em escala de genoma de telas de função em diversos sistemas de modelos humanos. Devido à simplicidade do CRISPR, esses tipos de telas são agora amplamente acessíveis a todos os pesquisadores, permitindo que mais cientistas utilizem métodos genéticos funcionais para estudar processos biológicos e doenças.
