Este protocolo permite garantir um bom isolamento de vesículas extracelulares e a notificação de um maior número de proteínas EBDF. Em comparação com outras técnicas de isolamento, esta sustenta que é mais integridade e atividades verticais. Os EVs estão sendo estudados cada vez mais em LC, bem como em condições patológicas.
Este método pode ser aplicado a qualquer sistema que escolhemos caracterizar e estudar os EVs. Para esse conteúdo ou para a ética biológica é necessária atenção especial ao iterar EVs, como na cultura resulta nos seguintes experimentos. Uma demonstração visual é fundamental para hospedar equipamentos específicos, como uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho caseiro, bem como o envolvimento do contador de nanopartículas e do espectrômetro de massa.
Ajudando a demonstrar o procedimento estará Antonella Raffo-Romero, do laboratório. Comece por vesículas extracelulares pré-isolando, ou EVs, a partir do meio de condição. Transfira a condição para o meio cultural de culturas microglia ou macrófago em um tubo cônico e centrífuga-a a 1.200 vezes G por 10 minutos para doar as células.
Transfira o supernatante para um novo tubo cônico e centrífuga por mais 20 minutos para eliminar corpos apoptóticos. Em seguida, transfira o supernatante para um tubo de policarbonato de 10,4 mililitros. Coloque o tubo em um rotor de TI de 70,1 e ultra centrífuga a 100.000 vezes G por 90 minutos a quatro graus Celsius para de pelotas dos EVs.
Após a centrifugação, descarte o supernascer e resuspenja a pelota em 200 microliters de PBS filtrados de 0,2 micrômetro. Para isolar os EVs, prepare uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho caseiro lavando e esterilizando uma coluna de cromatografia de vidro e colocando um filtro de 60 microliter na parte inferior. Empilhe a coluna com matriz de base de filtragem de gel de agarose cruzada para criar uma fase estacionária de 0,6 centímetros de diâmetro e 20 centímetros de altura.
Em seguida, enxágue a fase com 50 mililitros de PBS filtrados de 0,2 m. Se necessário, armazene a coluna a quatro graus Celsius para uso posterior. Coloque a pelota EV ressuspended em cima da fase estacionária e colete 20 frações sequenciais de 250 microliters enquanto continua a adicionar PBS ao topo da fase estacionária.
As frações podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius. Para realizar uma análise de rastreamento de nanopartículas, faça uma diluição de cada fração com PBS filtrado de 0,2 micrômetro e vórtice para eliminar agregados. Coloque a solução em uma seringa de um mililitro e coloque-a na bomba de seringa automatizada.
Em seguida, ajuste as configurações da câmera para o nível de ganho de tela apropriado e nível de câmera e clique em Executar. Carregue a amostra na câmara de análise com uma taxa de infusão de 1000 por 15 segundos. Em seguida, diminua e estabilize o fluxo de velocidade para gravação de vídeo para uma taxa de infusão de 25 por 15 segundos.
Capture três vídeos consecutivos de 60 segundos do fluxo de partículas. Em seguida, ajuste o nível da câmera e o limiar de detecção antes da análise de vídeo. Clique em Configurações OK para iniciar a análise e clique em Exportar quando terminar.
Lave o sistema com um mililitro de PBS filtrado de 0,2 micrômetros entre cada fração. Se realizar a análise da microscopia eletrônica, use um filtro centrífugo de 50 quilodalton para concentrar as frações de cromatografia de exclusão de tamanho. Para extração de proteínas, misture 50 microliters de tampão RIPA com a amostra de EV por cinco minutos no gelo.
Sonicar as amostras três vezes a 500 Watts e 20 kilohertz por cinco segundos. Em seguida, remova detritos vesiculares por centrifugação a 20.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Depois de isolar as proteínas, realize a migração de proteínas no gel de empilhamento de um gel poliacrílico de 12%.
Misture as proteínas no gel com Coomassie Blue por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, extire cada peça de gel colorido e cortá-lo em pequenos pedaços. Coloque as peças de gel através de uma série de lavagens sucessivas como descrito no manuscrito.
Em seguida, seque-os completamente com um concentrador de vácuo. Após a secagem, realize a redução de proteínas com 100 microlitradores de 100 milimolares de bicarbonato de amônio contendo 10 milimolares dithiothreitol por uma hora a 56 graus Celsius. Em seguida, realize a alquilação proteica com 100 microlitadores de 100 mililitros de amônio bicarbonato contendo iodoacetamida de 50 milimiliar por 45 minutos no escuro.
Lave as peças de gel de acordo com as instruções do manuscrito e seque-as completamente no concentrador de vácuo. Realize a digestão proteica com 50 microliters de trippsina em 20 mililitros de amônio bicarbonato a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, extraia as proteínas digeridas do gel com 50 microliters de 100% ACN por 30 minutos a 37 graus Celsius e depois 15 minutos em temperatura ambiente com agitação contínua.
Em seguida, extraia as proteínas duas vezes com 50 microlitadores de 5% TFA em 20 milimônios bicarbonato de amônio, enquanto mexe continuamente por 20 minutos. Adicione 100 microliters de ACN e continue mexendo por 10 minutos. Depois, seque as proteínas e resuspenque-as em 20 microliters de 0,1% TFA.
Desaltar a amostra usando uma ponta de pipeta de 10 microliter com c 18 mídia de fase inversa para desalizar e concentrar peptídeos. Em seguida, elute-los com ACN e 0,1% ácido fórmico. Seque completamente a amostra com um concentrador de vácuo e resuspenque-a em 20 microliters de ACN e 0,1% de ácido fórmico para espectrometria de massa cromatografia líquida tandem, ou LC-MS.
Coloque os peptídeos digeridos no instrumento e realize uma análise amostral. Para confirmar o isolamento do EV, cada fração de CCS foi submetida a uma análise de rastreamento de nanopartículas. O número de partículas foi significativamente maior nas frações cinco, seis e sete.
Essas frações foram agrupadas em uma amostra 2F-EV positiva, e comparadas com frações negativas EV, 1F-EV negativas e 3F-EV negativas, utilizando a análise de manchas ocidentais. Os resultados mostraram a presença da proteína de choque térmico 90 na amostra positiva de EV e no controle de lisecelulares. A microscopia eletrônica da amostra positiva de EV mostrou EVs em uma faixa de tamanho em torno de 100 nanômetros e 400 nanômetros.
A análise proteômica foi realizada com o objetivo de identificar proteínas contaminantes em amostras negativas de EV e caracterizar o conteúdo proteico dos EVs. As proteínas identificadas foram comparadas entre amostras positivas de 1F-EV e 2F-EV, bem como entre amostras positivas de 2F-EV e 3F-EV. Utilizando este método não direcionado, um pool de 536 proteínas foram submetidas ao banco de dados ExoCarta e levou à identificação de 86 proteínas associadas ao EV.
Além disso, essa piscina também permitiu a identificação de interações proteicas e suas funções biológicas associadas. Verificou-se que as proteínas da amostra positiva de EV desempenharam papéis em vias imunológicas e neuroprotetoras. Os efeitos dos EVs derivados de microglia foram avaliados no crescimento de neurite com células PC 12 e neurônios primários de ratos.
Observou-se aumento significativo do crescimento em EVs em comparação com o controle. Os EVs derivados do macrófago foram avaliados na invasão celular de glioma. Verificou-se que os EVs prejudicaram o crescimento e a invasão de glioma spheroids.
A coisa mais importante a se lembrar é realmente descartar cuidadosamente o supernascimento da etapa de ultracentrifugação, a fim de evitar a perda de EVs neste procedimento. Favorecemos uma abordagem em larga escala e não direcionada para focar em todo o conteúdo proteico e, em seguida, o efeito vertical dos EVs. assim o conteúdo em ácidos nucleicos pode ser associado usando análise.
Com essa abordagem de uma cultura primária, somos capazes de discriminar entre proteínas EV e proteínas livres que estão fora da variedade. Assim, a questão permanece se esta coagulação é artefato ou melhor, algum outro real
