Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da fisiologia vascular cerebral no que se refere à regulação do fluxo sanguíneo cerebral durante o envelhecimento e desenvolvimento de doenças crônicas. A principal vantagem desta técnica é que permite a medição simultânea do cálcio intracelular e potencial de membrana do endotélio arterial cerebral em sua forma nativa sob condições fisiológicas. Para isolar o cérebro do rato, sob o microscópio remova a pele e o cabelo sobre o crânio.
E remova o sangue excessivo com PSS frio sem cálcio. Em seguida, faça uma incisão usando apenas as pontas da tesoura de dissecção padrão. Começando pelo osso occipital e estendendo-se através do osso nasal do crânio.
Em seguida, abra seu crânio cuidadosamente ao longo da incisão, usando fórceps de ponta grosseira e separe o tecido conjuntivo para expor o cérebro. Lave suavemente o cérebro isolado com PSS frio sem cálcio em um béquer para remover o sangue. Coloque o lado ventral do cérebro para cima em uma câmara contendo solução de dissecção a frio para o isolamento das artérias cerebrais.
Para isolar as artérias cerebrais, fixar o cérebro isolado na solução de dissecção a frio, inserindo dois pinos de aço inoxidável através dele, em um revestimento de polímero de silício infundido com carvão na parte inferior de uma placa de petri de vidro. Posteriormente, isole cirurgicamente as artérias cerebrais posteriores em cerca de 0,3 a 0,5 centímetros dos segmentos posteriores de comunicação e basilares. Use pinos de aço inoxidável para fixar ambas as artérias cerebrais posteriores isoladas na solução de dissecção na placa de Petri.
Em seguida, limpe cuidadosamente as artérias cerebrais posteriores isoladas, removendo o tecido conjuntivo usando fórceps afiados de ponta fina. Corte as artérias intactas em segmentos de um a dois milímetros para digestão enzimática. Neste procedimento, prepare o aparelho de trituração usando um microscópio, uma câmera e um estágio de alumínio segurando uma câmara e micromanipuladores.
Fixar uma microsiringe com um controlador de bomba adjacente ao estágio e ao espécime. Em seguida, encha completamente uma pipeta de titulação com óleo mineral e fixe-a sobre o pistão de microsiringe. Em seguida, usando o microsiringe com o controlador da bomba retire cerca de 130 nanoliters de solução de dissociação na pipeta, garantindo a ausência de bolhas de ar.
Posteriormente, coloque segmentos arteriais intactos em um mililitro de solução de dissociação com concentrações necessárias de enzimas em um tubo de vidro de 10 mililitros. Incubar a 34 graus Celsius por 10 a 12 minutos para digestão parcial. Após a digestão, substitua a solução enzimática por cinco mililitros de solução de dissociação fresca.
Usando uma pipeta de um mililitro, transfira um segmento para a câmara contendo solução de dissociação à temperatura ambiente. Em seguida, coloque a pipeta na solução de dissociação na câmara e posicione-a perto de uma extremidade do vaso digerido. Defina uma taxa dentro da faixa de dois a cinco nanoliters por segundo no controlador da bomba para trituração suave.
Ao visualizar 100 vezes a 200 vezes a ampliação, retire e ejete o segmento arterial para dissociar células musculares lisas enquanto produz um tubo endotelial. Se necessário, use cuidadosamente fórceps finos para separar a adventitia dissociada e a lâmina elástica interna do tubo endotelial. Confirme que todas as células musculares lisas estão dissociadas e que apenas as células endoteliais permanecem como tubo intacto.
Usando micromanipuladores, fixe cada extremidade do tubo endotelial no deslizamento de tampa de vidro da câmara de superfusão usando pipetas de fixação de vidro borossilicato. Lave a adventitia dissociada e as células musculares lisas da câmara. E substitua a solução de dissociação por dois molar mais Cloreto de Cálcio PSS.
Transfira a plataforma móvel com tubo endotelial seguro para o microscópio de superfusão e plataforma experimental. Em seguida, use seis reservatórios limpos de 50 mililitros para a entrega contínua de PSS e respectivas soluções de medicamentos durante o experimento. Use a válvula de controle de fluxo em linha para definir manualmente a taxa de fluxo tão consistente quanto o fluxo de laminer enquanto corresponde a alimentação de fluxo à sucção do vácuo.
Entregue PSS na câmara para a superfusão do tubo endotelial por pelo menos cinco minutos antes de registrar os dados de fundo e o carregamento de corantes. Para medir o potencial da membrana simultaneamente com concentração intracelular de cálcio, puxe um eletrodo afiado e encha-o com dois cloreto de potássio molar para registrar a partir de células carregadas com corante fura-2. Para estudar o acoplamento intracelular via transferência de corante, encha o microeletrou com iodeto de 0,1% de propidium dissolvido em dois cloreto de potássio molar.
Em seguida, coloque o eletrodo sobre um fio de prata revestido com cloreto no suporte de pipeta preso a um estágio de cabeça eletrometro preso com um micromanipulador. Use o micromanipulador para posicionar brevemente a ponta do eletrodo no PSS que flui na câmara, enquanto visualiza através do objetivo quatro vezes. Posteriormente, defina o potencial da membrana de repouso a zero como consistente com o potencial de banho aterrado.
Se desejar, use monitores de linha de base audíveis ligados a eletrometros para associar o tom sonoro a gravações potenciais. Depois, aumente a ampliação para 400 vezes usando um objetivo de 40 vezes e posicione a ponta do eletrodo logo acima da célula do tubo endotelial. Ajuste a janela fotométrica usando o software de fotometria para focar em cerca de 50 a 80 células endoteliais.
Em seguida, coloque suavemente o eletrodo em uma das células do tubo endotelial usando o micromanipulador e espere pelo menos dois minutos para que o potencial da membrana de repouso se estabilize. Uma vez que o potencial da membrana de repouso seja estável em seu valor esperado, ligue o tubo fotomultiplier na interface da fluorescência na ausência de luz e comece a aquisição da concentração intracelular de cálcio pelo excitante Fura-2 alternadamente em 340 e 380 nanômetros enquanto coleta a emissão de floresnce a 510 nanômetros. Uma vez estabelecidas medidas simultâneas do potencial da membrana e da concentração intracelular de cálcio, permita cerca de cinco minutos para a superfusão do tubo endotelial com PSS a uma taxa de fluxo laminar constante antes da aplicação de drogas.
Aplique a droga preparada em PSS na câmara de superfusão a uma taxa de fluxo constante. Durante o tratamento medicamentoso mede o potencial da membrana nas proporções F340/F380 simultaneamente. Uma vez feito o experimento, retire o eletrodo da célula.
Em seguida, pare as respectivas gravações de potencial de membrana e concentração intracelular de cálcio e salve os arquivos para análise de dados. Esta é uma imagem de contraste de interferência diferencial de um tubo endotelial arterial cerebral do rato, ajustado para experimento em janela fotométrica usando um objetivo de 40 vezes. Um eletrodo afiado é colocado em uma célula, como mostrado na parte superior da imagem.
Aqui estão os exemplos de traços brutos para medição simultânea da razão F340/F380 e potencial de membrana em resposta a 100 ATP micromolar. Após este procedimento, outros métodos como microscopia fluorescente confocal, podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais sobre a sinalização de microdomina de cálcio endotelial, e espécies reativas de oxigênio, como exemplos. Em geral, essa técnica continuará a abrir caminho para pesquisas em fisiologia celular explorarem a função vascular e o envelhecimento no sangue e na circulação linfática.
