Este método fornecerá uma melhor visão da função do endotélio arteriolar parenchímal que liga diretamente o fluxo sanguíneo intracerebral ao abastecimento da atividade neuronal e gliana em todo o cérebro. Uma vantagem técnica distinta sobre o endotélio arteriole é a resolução aprimorada de dimensões morfológicas e sinalização de cálcio e elétrica entre células endoteliais intracerebrais individuais e suas respectivas organelas. Inicialmente, o isolamento e o exame do endotélio intracerebral serão muito desafiadores.
No entanto, é possível dominar essa técnica com muita prática acompanhada de paciência e dedicação. Lave o cérebro isolado com uma solução de dissecção fria em um béquer ou placa de Petri para remover o sangue restante da superfície do cérebro. Coloque o lado do cérebro ventral voltado para cima em uma câmara contendo solução de dissecção a frio para isolar arteriolas parenchímicas.
Para isolar as artérias parenchímicas, proteja o cérebro isolado com pinos de aço em solução de dissecção a frio em uma placa de Petri contendo mais de 50 centímetros de revestimento de polímero de silício infundido com carvão profundo. Corte um retângulo de tecido cerebral de ambos os hemisférios com uma tesoura de dissecção afiada e alinhada ao redor do MCA, garantindo que a parte superior do segmento tecidual passe do ponto de ramificação do círculo de Willis. Fixar o tecido cerebral no prato com o MCA voltado para cima com pinos de aço.
Faça cuidadosamente uma incisão rasa perto dos pinos e remova a pia com pequenas fórceps, descascando suavemente de uma extremidade em direção à outra. Segure cuidadosamente a pia isolada com artérias parenchímicas ramificadas da MCA no prato com os pinos e disseque cuidadosamente as artérias parenchímicas. Corte todos os ramos distais restantes e certifique-se de que a arteriola esteja limpa sem tecido preso.
Use esta artéria intacta limpa para digestão enzimática. Alternativamente, corte cada arteriola em dois pedaços para digestão enzimática para preparar tubos endoteliais, se desejar. Para digestão parcial dos segmentos arteriolares, coloque segmentos arteriolares intactos em um mililitro de solução de dissociação em um tubo de vidro de 10 mililitros contendo papain, dithioerythritol, colagenase e elastase.
Incubar segmentos arteriolares a 34 graus Celsius por 10 a 12 minutos. Para isolar o tubo endotelial arteriolar, coloque a pipeta de trituração presa com o injetor de micro seringa na solução de dissociação na câmara e posicione-a perto de uma extremidade do segmento de vaso digerido. Defina uma taxa dentro do intervalo de um a três nanoliters por segundo no controlador da bomba para trituração suave.
Mantendo a ampliação de 100X a 200X, retire o segmento arteriolar na pipeta e, em seguida, injete para dissociar a adventitia e as células musculares lisas. Triturar o segmento do vaso até que todas as células musculares lisas sejam dissociadas e apenas as células endoteliais permaneçam como um tubo intacto. Com micro manipuladores, fixe cada extremidade do tubo endotelial no deslizamento de tampas de vidro na câmara com pipetas de fixação de vidro borossilicato Para medir o potencial da membrana endotelial, ao mesmo tempo em que visualiza através do objetivo 4X, posicione cuidadosamente a ponta de eletrodo afiado pouco mais de uma célula do tubo endotelial arteriolar na solução de sal fisiológico fluindo com um micromúdico manipulador.
Aumente gradualmente a ampliação para 400X e reposicione a ponta do eletrodo conforme necessário. Usando o micro manipulador, insira suavemente a ponta de um eletrodo afiado em uma das células do tubo endotelial e comece a gravar VM usando um eletrometro. Uma vez que o VM de repouso endotelial esteja estável de menos 30 a menos 40 milivolts, aplique os agentes farmacológicos desejados por objetivo experimental.
Carregue o tubo endotelial com o rastreador de fluorescência para a membrana plasmática ou organela desejada a 37 graus Celsius por 15 a 30 minutos. Lave as células com solução de sal fisiológico de superfusão fresca e imagem de células vivas sob o microscópio no comprimento de onda de excitação dos respectivos corantes. A função endotelial foi avaliada medindo o potencial de cálcio intracelular e membrana em resposta a um agente farmacológico MTA, um potente agonista receptor purinérgico a 37 graus Celsius.
Após a aplicação de um MTA micromolar, a concentração intracelular de cálcio aumenta rapidamente com uma hiperpolarização concomitante. Além disso, o endotélio intacto foi incubado a 37 graus Celsius com rastreadores fluorescentes para visualização para examinar a morfologia celular. Imagens de células endoteliais ao vivo mostraram co-coloração para membrana plasmática e núcleos.
A membrana plasmática foi manchada juntamente com uma mancha fluorescente de órticulo endoplasmático em que áreas de aparente sobreposição de ER nas proximidades da membrana plasmática aparecem laranja. O experimentador deve ter cuidado durante a dissecção e isolamento para evitar danos às artérias porque uma arteriola danificada definitivamente não produzirá um tubo endotelial intacto. Após o procedimento, as células podem ser utilizadas para imunohistoquímica fixa com anticorpos fluorescentes ou coloração de células vivas de organelas e lipídios de membrana.
Essa técnica gerará novas informações para a compreensão dos mecanismos subjacentes ao fluxo sanguíneo cerebral no nível fundamental da fisiologia e selecionará transições para a patologia para a terapia.
