A vasculatura cerebral é uma complexa rede de arterias penetrantes, capilares e venules ascendentes. Estes vasos são envoltos por células mural, como pericytes ensheathing, que expressam actina muscular suave alfa, e são encontrados dentro dos quatro primeiros ramos de arterials penetrantes. Utilizamos acta2-RCaMP 1.07 camundongos transgênicos, para visualizar transitórios de cálcio nessas células, através da expressão do indicador de cálcio geneticamente codificado RCaMP.
O cálcio desempenha um papel forte na contração dessas células e no controle do fluxo sanguíneo. Pericytes capilares são encontrados mais a jusante na rede vascular e podem ser rotulados em outros modelos transgênicos. No entanto, focamos em pericytes ensheathing neste método.
Nossos camundongos foram implantados cirurgicamente com uma janela craniana crônica que permite acesso à vasculatura cerebral para imagem. Aqui, descrevemos os passos necessários de preparação e a injeção da veia da cauda seguidas pelos dois métodos de imagem de fótons e analíticos necessários para a aquisição de dados de cálcio pericíte e informações sobre o fluxo sanguíneo em animais anestesiados. Os seguintes itens são necessários para uma injeção de cateter de veias da cauda: seringas de insulina, um pedaço de 15 centímetros de tubo PE10, agulhas de calibre 30, gaze, soro fisiológico, fórceps, corante de fluoresceína verde, alicate e tesoura.
Também temos uma agulha com anestesia de cetamina Xylazine que injetaremos antes da imagem, pois é melhor que isoflurane para medições de fluxo sanguíneo. Usando o alicate, quebre uma agulha calibre 30 do cubo. Insira cuidadosamente a agulha na extremidade do pedaço de tubo PE10 preso a uma seringa salina cheia.
Este é o cateter para injeção. Anestesiar um rato com isoflurane e aplicar gel I-Lube. Coloque um campo de luvas com água morna na cauda para dilatar a veia lateral.
Depois de limpar a cauda com etanol, insira a agulha na veia e injete suavemente soro fisiológico através do cateter para garantir que a agulha seja colocada corretamente. Troque a seringa no cateter por uma seringa cheia de corante de fluoresceína dextran. Injete lentamente o corante para garantir que não haja bolhas no tubo.
Substitua a seringa dextran pela seringa salina e enxágue a tubulação até que não haja corante no tubo. Retire a agulha e pressione com gaze. Injete anestesia de cetamina Xylazine para imagem.
Com a cabeça do mouse fixada em uma almofada de aquecimento, limpe a janela craniana com aplicadores dentários. Aplique gel de ultrassom na janela e foque através do objetivo do microscópio de dois fótons. Para duas imagens de fótons, usamos um microscópio com laser de safira de titânio afinado para fluorescentes, excitação e tubos fotomultiplier para detecção de emissões.
No software do microscópio, defina o comprimento de onda para 990 nanômetros para excitar tanto rcamp quanto fluoresceína dextran. Em seguida, ajuste a potência do laser ajustando a tensão celular do pockel e a sensibilidade do detector PMT. Podem ser vistas varreduras ao vivo com esses parâmetros e maior resolução, células mural positivas RCaMP e o plasma de sangue fluorescentemente rotulado.
Recomenda-se a aquisição de uma pilha de profundidade para localizar adequadamente os pericítos na rede vascular. Quando estiver focado no topo do tecido perto dos vasos po, coloque isso como o ponto zero e o topo da pilha da série Zed, em seguida, concentre-se no tecido para a profundidade desejada e ajuste isso como a parte inferior da pilha. A potência do laser deve ser ajustada para aumentar à medida que o microscópio se move mais fundo através da pilha.
Abrindo a série Zed no software de processamento de imagens, mescla os dois canais como imagens coloridas e digitalize através da pilha para pericytes e vasos sanguíneos de interesse. Selecione regiões de interesse que contenham pericítos e salve as posições para ajudar a localizar esses pontos novamente em sessões futuras de imagem. Para coletar e mover um evento de cálcio pericíte, aumente a taxa de quadros de aquisição para mais de 10 quadros por segundo.
Defina a duração da imagem para 60 segundos e atualize o caminho de salvamento com um nome de arquivo único. Zoom opticamente no vaso para dar conta da resolução mais baixa e para obter uma visão mais próxima do pericyte. Adquira a série T.
Para medir o diâmetro do vaso sanguíneo e a velocidade dos glóbulos vermelhos, selecione a varredura de linha para iniciar uma varredura unidimensional com o microscópio. Primeiro defina a duração da varredura em milissegundos. Em seguida, desenhe uma linha que bissecte o navio de interesse e se move paralelamente ao longo da nave.
Isso vai gerar um kymograph do diâmetro do vaso à esquerda e listras dos glóbulos vermelhos movendo-se através do vaso à direita. Consulte a tabela de materiais para obter uma lista completa de programas e pacotes utilizados neste protocolo. Primeiras regiões de interesse selecionadas manualmente no software de processamento de imagens.
Carregue o arquivo da série T, pegue a média da pilha e faça uma imagem colorida. Selecione a ferramenta polígono e delineie as estruturas de pericítos de ensheathing visíveis, como soma e processos. Dê a cada região de interesse um nome único e salve-os como uma pasta zip que pode ser carregada mais tarde no software de programação.
Abra o software de programação e certifique-se de que as pastas dos pacotes de processamento de imagens estejam no caminho. Importe a série T de cálcio para o software de programação e defina o que está em cada canal. Neste caso, é um sinal celular no canal um e plasma de sangue no canal dois.
Plote os dados como um filme dentro do software de programação para facilitar a visualização. Para remover fluorescentes verdes do fluoresceína dextran que sangra através do canal RCaMP vermelho, un-mixe os canais no pacote de processamento de imagem. Primeiro selecione uma região que contenha apenas fluoróforo 1, RCaMP neste caso.
Segunda escolha uma região que só contém fluoróforo 2, fluoresceína no plasma. Por fim, selecione uma área de fundo que não tenha fluoróforo. Isso gera uma matriz de contribuição espectral, que é aplicada a cada pixel em cada canal.
Melhora significativamente a localização do sinal RCaMP, o que aumentará a detecção de eventos de cálcio nessas estruturas. Existem várias maneiras pelas quais os dados de imagem de cálcio podem ser analisados dentro dos pacotes de processamento de imagens. Primeiro execute a análise de sinalização celular no filme de cálcio não misturado e carregue as regiões de interesse da pasta zip que foram selecionadas dos pericítes manualmente.
Defina o fator escala para um porque as regiões não precisam ser redimensionadas. Após o processamento, gere parcelas de cada ROY e os traços de cálcio normalizados em cores diferentes. Se o código não detectar a maioria dos eventos de cálcio nos traços individuais, modifique os parâmetros incorporados dentro da caixa de otimização, como a diminuição do limiar para o passe curto de dados filtrados para três vezes o desvio padrão do período de linha de base, que são os primeiros 30 quadros da série T.
Para detectar e classificar os sinais, o traço de cálcio normalizado é filtrado por passagem longa e passagem de banda, o que ajuda a suavizar os dados para amplitude e com estimativas, mas também para determinar se os sinais são picos únicos, vários picos ou platôs. Exaú-los como um arquivo CSV para análise estatística posterior. Execute a análise de sinalização celular uma segunda vez no filme de cálcio não misturado e selecione a região automatizada de identificação de juros com base na atividade e mudança de fluorescentes em três dimensões, X, Y e tempo.
Traçar os resultados do processo para visualizar as regiões de interesse identificadas são cores diferentes. Se o algoritmo não detectar ROYs claramente visíveis olho no filme, modifique os parâmetros incorporados, como o aumento do filtro gaussiano que suaviza os dados a tempo e diminui o limiar para encontrar ROYs para três vezes o desvio padrão da linha de base. Plote os ROYs como um filme para visualização posterior.
Exaú-los como um arquivo CSV para análise estatística posterior. Importe o arquivo de dados kymograph de linha para o software de programação e defina o que está em cada canal. Execute a função de análise de diâmetro na varredura de linha, que abre uma caixa para selecionar a área que corresponde ao diâmetro no kymograph.
Desenhe uma caixa fora dos limites fluorescentes do kymógrafo, que corresponde ao diâmetro do vaso. Processe essa classe de dados para medir a largura total em metade máxima para o diâmetro do vaso e gerar um lote. Em seguida, execute a taxa de velocidade na análise de transformação e desenhe uma caixa dentro da borda dos fluorescentes de kymograph.
Processe essa classe de dados para calcular a velocidade, o fluxo e a densidade linear dos glóbulos vermelhos. Saída os resultados do fluxo sanguíneo como um arquivo CSV para análise mais aprofundada. Selecionar estruturas celulares manualmente permite a detecção de flutuações de cálcio dentro dessas regiões, incluindo diferentes tipos de picos de sinal, como picos únicos e vários picos, depois que os traços de cálcio normalizados são baixos passes e passagem de banda filtrados.
Além disso, regiões de interesse são identificadas pelo agrupamento de pixels ativos onde a intensidade dos fluorescentes muda ao longo do tempo usando algoritmos de processamento de imagem. Isso pode ser aplicado a qualquer sinal celular dinâmico ajustando o tempo, limiar e parâmetros espaciais para abranger o tamanho e a forma esperados do sinal. A diminuição do limite para identificação de sinal encontra mais regiões de interesse.
Kymographs hemodinâmicos claros são analisados para medir o diâmetro e a velocidade dos glóbulos vermelhos em vasos sanguíneos perto de pericytes ensheathing. O diâmetro é calculado a partir da largura total na metade do máximo das fluorescentes. A velocidade dos glóbulos vermelhos é aproximada das listras feitas de glóbulos vermelhos sem rótulo, onde o ângulo é entrada em uma transformação de radon para calcular a velocidade.
Kymographs de má qualidade, onde há saturação fluorescente, má relação sinal/ruído, ou movimento do campo de imagem, cria parcelas não confiáveis com pontos de erro, indicados como cruzes vermelhas, onde os dados não podem ser determinados. A qualidade dos dados adquiridos é fundamental para um bom resultado e seguir as etapas descritas neste protocolo garante bons resultados. Neste vídeo, descrevemos o procedimento para imagens combinadas de cálcio de pericítos ensheathing cerebral e medidas de fluxo sanguíneo por duas microscopia de fótons.
Essas técnicas são úteis para abordar questões sobre fisiologia celular mural e localização dentro da rede vascular cerebral, mas podem ser adaptadas para estudar transitórios de cálcio em qualquer tipo de célula no cérebro ou em outro sistema de órgãos.
