Este protocolo descreve a nova técnica para enriquecimento simultâneo de múltiplos PTMs com anticorpos seguidos de análise de espectrometria de massa de aquisição independente de dados para obter insights biológicos sobre localização do local e cross-talk. Trata-se de uma técnica de tempo e custo-benefício que permite a identificação simultânea e quantificação de peptídeos com corte contendo PTMs de acetilação e succinilation com apenas pequenas quantidades de entrada amostral. O acompanhamento das modificações pós-translacionais é um passo importante na caracterização e combate a diferentes estados da doença.
Já sabemos que certos cânceres e diabetes são altamente regulados através dessas modificações proteicas. Este método pode teoricamente aplicar-se a quaisquer PTMs com anticorpos para enriquecimento, como ubiquização, fosforilação e outros. Também pode se aplicar a outros tipos de tecidos ou modelos de cultura celular.
A chave para obter dados valiosos usando essa técnica é a reprodutibilidade. Isso pode ser alcançado garantindo que todas as etapas sejam realizadas com muito cuidado, particularmente as etapas que envolvem as contas de anticorpos. Para começar, obtenha cartuchos contendo resina C18 que combinavam até 10 miligramas de proteína.
Coloque esses cartuchos em um aparelho de vácuo. Adicione 800 microliters de 80% de acetonitrilo e 0,2% de ácido fórmico aos cartuchos com 19,8% de água e inicie a sucção a vácuo para puxar o líquido. Repita esta etapa uma vez evitando a secagem dos cartuchos completamente.
Equilibre os cartuchos adicionando 800 microliters de ácido fórmico de 0,2% na água com sucção a vácuo. Repita isso duas vezes. Carregue um peptídeos miligramas em cerca de 1.000 microliter solução nos cartuchos com sucção a vácuo.
Lave os peptídeos duas vezes com 800 microliters de ácido fórmico de 0,2% na água sob sucção a vácuo. Em seguida, organize tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro sob cada cartucho para coletar o peptídeo. Sob sucção a vácuo, peptídeos elutos de cartuchos primeiro com 800 microliters de 80% de acetonitrilo e 0,2% ácido fórmico em 19,8% de água, em seguida, com 400 microliters da mesma solução.
Seque as amostras de peptídeos dessaladas completamente em um concentrador de vácuo por duas a três horas. Agora, resuspenque os peptídeos secos em 1,4 mililitros de tampão de purificação de imunoaffinity frio 1X. Vórtice para misturar e garantir um pH de aproximadamente 7.
Centrifugar as amostras a 10.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Uma pequena pelota aparece. Coloque os peptídeos de lado no gelo enquanto prepara contas de anticorpos.
Adicione um mililitro de PBS frio 1X a um tubo contendo 100 microliters de pasta de anticorpos de tértil K e um tubo contendo 100 microliters de pasta de anticorpo k-succinyl e misture por pipetação. Transfira toda a solução para novos tubos de 1,5 mililitros e gire em uma centrífuga em miniatura por 30 segundos à temperatura ambiente. Aspire o PBS tomando cuidado para evitar aspirar quaisquer contas.
Repita a lavagem três vezes adicionais. Em seguida, resuspende as contas em cerca de 440 microliters de PBS. Pipeta as contas várias vezes para misturar bem.
Com 200 dicas de pré-corte de microliter, transfira 100 microliters de cada linha de anticorpos acetilosinas e contas de anticorpos de succinil à flor da pele para um novo tubo. Gire por 30 segundos em uma centrífuga em miniatura e aspire fora da mídia com uma ponta de carregador de gel. As contas agora ficam brancas.
Pipeta o peptídeo resuspended diretamente sobre as contas lavadas e incubar os peptídeos com contas a quatro graus Celsius durante a noite com agitação. Pela manhã, gire as amostras de peptídeos a 2.000 vezes g por 30 segundos a quatro graus Celsius. Remova o supernatante contendo peptídeos não ligados e guarde para experimentos futuros, se desejar.
Adicione um mililitro de tampão de purificação de imunoaffinity frio 1X às contas para lavar e misturar invertendo cinco vezes. Gire a 2.000 vezes g por 30 segundos a quatro graus Celsius. Aspire a solução de purificação do imunoaffinity e repita a lavagem da purificação do imunoaffinity passo mais uma vez.
Em seguida, adicione um mililitro de água HPLC fria às contas e misture invertendo cinco vezes. Gire a 2.000 vezes g por 30 segundos a quatro graus Celsius. Aspire fora da água e repita a etapa de lavagem de água duas vezes adicionais.
Gire um tempo adicional a 2.000 vezes g por 30 segundos a quatro graus Celsius para coletar qualquer água restante no fundo do tubo. Com pontas de carregamento de gel de ponta plana, aspire qualquer água extra que tenha coletado. Tenha cuidado para evitar aspirar as contas.
Adicione 55 microliters de ácido trifluoroacético de 0,15% na água às contas. Incubar as contas por 10 minutos à temperatura ambiente enquanto ocasionalmente toca a parte inferior do tubo para misturar. Gire as contas à temperatura ambiente por 30 segundos em uma centrífuga em miniatura.
Use uma ponta de carregamento de gel de ponta plana para transferir os peptídeos elucidos para um novo tubo. Adicione 45 microliters de ácido trifluoroacético de 0,15% na água às contas. Incubar por 10 minutos à temperatura ambiente enquanto toca na parte inferior do tubo ocasionalmente para misturar.
Gire as contas à temperatura ambiente por 30 segundos na centrífuga em miniatura. Remova a segunda elução usando uma ponta de carregamento de gel de ponta plana e misture-a com a primeira elução. Gire os peptídeos elucidos combinados a 12.000 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente para pelotar quaisquer contas que se sobressiam.
Transfira a solução da amostra de peptídeos para um novo tubo de 500 microliter. Construa o método de carregamento para carregar as misturas de peptídeos enriquecidos em um chip pré-coluna C18 e salgue novamente os peptídeos lavando com a fase móvel A em dois microliters por minuto durante 10 minutos. Construa o método de cromatografia de modo que os peptídeos sejam transferidos para uma coluna analítica e elute a uma taxa de fluxo de 300 nanoliters por minuto com um gradiente de duas a três horas usando as fases móvel A e B.Especificamente, use um gradiente linear de 5% da fase B móvel para 35% da fase B móvel ao longo de 80 minutos.
Posteriormente, aumente a fase móvel B para 80% ao longo de cinco minutos e depois mantenha em 80%B por oito minutos antes de retornar a 5%B para uma ree equilíbrio de 25 minutos. Em seguida, construa um método de instrumentos MS para aquisição dependente de dados. Para o experimento um, configure a varredura de íons precursores MS1 de M/Z 400 a 1.500.
Defina a duração para 120 minutos. Crie um experimento IDA e clique em OK. Na guia de critérios de switch, defina o limiar de intensidade para acionar as varreduras de MS/MS para íons de estados carregados entre duas a cinco a 200 contagens por segundo. Defina a exclusão dinâmica dos íons precursores para 60 segundos.
Para o experimento dois, defina a digitalização do produto MS/MS com uma faixa de varredura MS2 de M/Z 100 a 1.500. Clique nos parâmetros de edição e defina a energia de colisão para cinco e selecione o modo de digitalização de íons do produto de alta sensibilidade. Por fim, coloque a amostra no autosampler.
Envie a fila de amostras e inicie os métodos de aquisição do LC-MS/MS, construindo um método de instrumentos MS para aquisição independente de dados e definindo dois experimentos de varredura de instrumentos. Realize as varreduras de íons precursores do MS1 de 400 a 1.250 massas para carregar e definir a duração para 120 minutos. Defina a energia de colisão para 10 e o tempo de acumulação para 45 milissegundos e selecione o modo de digitalização de íons do produto de alta sensibilidade.
Em seguida, importe um arquivo de texto contendo o esquema de aquisição de 64 janelas de janela variável DIA SWATH para preencher janelas de aquisição swath no método. Neste esquema de aquisição, janelas variáveis que variam de cinco a 90 massas para carga e largura são passadas em etapas incrementais sobre a faixa de massa total de 400 a 1.250 massas para carregar com um total de 64 segmentos SWATH cada um com um tempo de acumulação de 45 milissegundos. Ajuste o tempo de acumulação do MS1 para 0,25 segundos.
Juntos, a varredura MS1 e 64 ms2 scans devem agora produzir um tempo total de ciclo de 3,2 segundos. Neste estudo, os resultados experimentais documentaram a possibilidade de detectar e avaliar o cross-talk do PTM. Esta tabela mostra como a linha do tempo do fluxo de trabalho e as quantidades de amostra e proteína necessárias.
O método de um pote pode ser realizado pela metade do tempo e com metade do número de amostras como esses métodos alternativos. O coeficiente mediano de variação para as áreas de peptídeo modificado foi menor no método de um pote do que no único PTM e enriquecimento PTM serial. Ao comparar os métodos de enriquecimento PTM de um pote e um único PTM, não foram aparentes diferenças notáveis entre as correlações da quantificação do nível do local para as duas modificações.
Esta figura exibe dados de um enriquecimento bem sucedido e ilustra um exemplo para um peptídeo contendo múltiplas e diferentes modificações de acicl visualizando o conversão de PTM. Um peptídeo foi acetilado em um resíduo de lise e succilyado no outro, enquanto aqui o mesmo peptídeo foi succilyado em ambas as lises. Isso demonstra que o mesmo resíduo de liseina pode ser modificado com ambos os grupos de aciclização e há a possibilidade de conversa cruzada ocorrer naquele local.
É essencial garantir que cada amostra contenha a mesma quantidade de contas e certifique-se de que nenhuma das contas seja aspirada acidentalmente ao lavar contas de ligação de peptídeos. A especificação em massa baseada em perfil e análise de dados em ferramentas de software como o Spectronaut são realizadas após este procedimento para identificar, quantificar e realizar a localização do local de PTMs. Esse fluxo de trabalho de aquisição independente de dados em combinação com o enriquecimento simultâneo de PTM abrirá caminhos para avaliar de forma mais eficiente o cross-talk do PTM e fornecer melhores insights sobre a relevância da sinalização ptm.
