Este método pode nos ajudar a responder perguntas-chave no campo do imuno-metabolismo. A vantagem dessa técnica é que ela permite a quantificação de mitocôndrias ou lysosomos em células vivas individuais, em uma mistura complexa de diferentes tipos de células. Este método para estudar células T e B também pode ser aplicado a muitos outros tipos de células, como macrófagos, células dendríticas ou quaisquer células primárias colhidas a partir de uma amostra de tecido.
O procedimento será demonstrado por Chin-Wen Wei, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para rotular as organelas para quantificação, primeiro, adicione uma vez dez ao sexto mouse células T a um tubo de fax inferior redondo por marcador. E pelotar as células por centrifugação.
pré-aquecido a 37 graus Celsius meio de cultura livre de soro para diluir as soluções específicas de estoque de sonda organela para concentrações finais de trabalho no meio. E suspender as células em 100 microliters de tinta sonda por tubo. Em seguida, incubar as células em uma incubadora de cultura celular para o período de coloração adequado, interrompendo a reação no final da incubação com um mililitro de tampão de fax frio por tubo.
Em seguida, colete as células com outra centrifugação e suspenda novamente as pelotas em 100 microliters do hibrinato 24G2 pré-titulado no gelo. Após dez minutos, adicione um mililitro de tampão de fax por tubo. Colete as células por centrifugação e rotule as células com 50 microlitres do coquetel de anticorpos conjugados de fluorescência pré-titulado.
Adicione a concentração apropriada de acordo com a tabela. E tampão de fax por 20 minutos no gelo, protegido da luz. No final da incubação, adicione um mililitro de tampão de fax por tubo.
Recolher as células por centrifugação. E suspenda as células em 300 microliters de fax tampão suplementado com um micrograma por mililitro de iodeto de propídio. Imediatamente após a adição do contra-depósito nuclear e cromossomo, ligue o computador de análise do cítmetro de fluxo, o citômetro de fluxo, o software de aquisição de fax e quaisquer outros dispositivos acessórios, dependendo da plataforma da máquina.
Execute o PBS através do sistema por cerca de um minuto para garantir que a linha de fluxo esteja cheia de PBS e com o buffer. Abra um novo experimento e defina os parâmetros do cítômetro de acordo com as instruções do fabricante. Filtre as células através de um filtro de células de 70 micrômetros.
E vórtice antes da aquisição de cada amostra para evitar aglomerados e formação de doublet. Abra a configuração De compensação automática e crie parcelas de pontos para cada parâmetro fluorescente. Depois de definidas todas as tensões, ajuste a compensação e aplique a compensação às amostras.
Crie uma trama de dispersão para a frente versus dispersão lateral e otimize as tensões para que as células de interesse apareçam dentro da trama. Crie uma dispersão para a frente versus o gráfico de altura de dispersão para a frente e gate as células únicas. Crie uma área de dispersão para a frente contra o enredo da área de dispersão lateral e portão dos linfócitos.
Crie uma área de dispersão para a frente versus propidium iodeto plot e portão as células vivas. Depois de definidas todas as tensões, ajuste a compensação e aplique a compensação às amostras. Em seguida, carregue o primeiro tubo amostral, crie as parcelas apropriadas do marcador de superfície celular e colete pelo menos 1.000 eventos da população de interesse.
Quando todas as amostras tiverem sido executadas, exporte os dados de fluxo para análise posterior. E salvar o experimento como um modelo para preservar as configurações e parâmetros do citômetro para experimentos semelhantes no futuro. O conteúdo mitocondrial final do site é o menor em células T duplamente negativas, pico em duplo estágio negativo dois e três, e ligeiramente diminuir em duplo estágio negativo quatro.
Com timócitos duplo positivos demonstrando maior número de mitocôndrias do que os timócitos positivos CD4 e CD8, sugerindo que os conteúdos mitocondriais flutuam durante o desenvolvimento. Os timócitos positivos CD4 e CD8 apresentam uma maior intensidade de fluorescência média mitocondrial do que as células CD4 ou CD8 T, sugerindo que as células T ingênuas que recirculam no ambiente sanguíneo rico em oxigênio têm uma massa mitocondrial ainda menor que os timócitos. Curiosamente, essa redução do conteúdo mitocondrial é mais proeminente no CD8 do que na linhagem celular CD4 T, e a ativação celular T diminui ainda mais a presença dessas organelas.
Relativamente baixo, mas detectável, o conteúdo lyosomal é observado em todas as populações de timócitos, com uma presença mais proeminente em dois timócitos negativos. Na periferia, um número relativamente alto de lysosos são detectados em células T positivas de memória e efeito CD8. Combinar corantes específicos de organela e marcador de superfície com citometria de fluxo é uma maneira poderosa de caracterizar o estado metabólico das células em uma mistura complexa.
Corante específico de organela adicional pode ser usado para detectar ânticulo endoplasmático, vacuole autofágico ou outro compartimento intracelular de interesse.
