O trabalho foi apoiado por uma bolsa da leucemia UK para ETB e MJA.

Amostras de sangue foram obtidas de indivíduos normais (NS) (n = 12) bem como pacientes com linfoma de zona marginal (MZL) (n = 7) e outros tipos de linfoma de células B não-Hodgkin (BNHL) (FL 6 pacientes, 2 pacientes de linfoma linfoplasmacítico e 1 baixo grau B-pilha Linfoma não-Hodgkin não especificados paciente). Os pacientes foram recrutados as clínicas de Hematologia no Leicester Royal enfermaria depois de ter dado consentimento, escrito, com aprovação ética no lugar em todos os estudos. Aprovação ética foi obtida por Leicestershire, Northamptonshire e Rutland pesquisa ética Comissão 1, 06/Q2501/122 de referência para as amostras dos pacientes e a autoridade de investigação de integridade (HRA) NRES Comité East Midlands-Derby, referência 14/EM/1176 para indivíduos normais.
1. isolamento de CD4+ T-células do sangue periférico inteiro
<ol><li>Tome sangue periférico fresco (2 a 15 mL) em tubos de EDTA K2por venopunção padrão e processo logo que possível para manter a viabilidade máxima. Nota: Usar equipamento de proteção pessoal padrão de laboratório (casaco, luvas, óculos, etc.) e realizar o trabalho em uma classe II gabinete de biossegurança.</li>
	<li>Trazer o sangue e todos os reagentes necessários (CD4+ enriquecimento cocktail, 2% fetal bovino soro/tamponada fosfato solução salina (FBS/PBS), mídia de gradiente de densidade e congelamento médio se cryopreserving células) à temperatura ambiente.</li>
	<li>Misturar o sangue com um cocktail comercialmente disponível de anticorpos para o enriquecimento de CD4 humano+ células T. Use 50 µ l de reagente para cada 1 mL de sangue. Use um tubo de polipropileno cônico de 50 mL para 5 a 15 mL de sangue. Nota: Se usar 2 a 4 mL de sangue, execute esta etapa em um tubo de polipropileno cônico 14 mL.</li>
	<li>Incube a mistura à temperatura ambiente por 20 min.</li>
	<li>Dilua a mistura com um volume igual de 2% FBS/PBS</li>
	<li>
Esta mistura diluída em cima da mídia gradiente de densidade lentamente para evitar perturbar a interface e proceder a centrifugação imediatamente para evitar a difusão do sangue no meio de gradiente de densidade da camada.
	<ol>
<li>Para 2 a 3 mL de sangue, usar 3 mL do meio de gradiente de densidade em um tubo de polipropileno cônico 14 mL, mas para 4 mL de sangue, use 4 mL de meio de gradiente de densidade em um tubo de polipropileno cônico 14 mL e pelo sangue de 5 a 15 mL , use 15 mL do meio de gradiente de densidade em um tubo de polipropileno cônico de 50 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar a mistura em camadas por 20 min a 1.200 x g com o freio fora a 20 ° C. Nota: Uma temperatura abaixo da temperatura ambiente pode resultar na contaminação com hemácias e granulócitos. Uma velocidade mais baixa fará com que o CD4+ processo de isolamento para falhar. Deixar o intervalo de noivos irá diminuir o rendimento da célula. Use uma centrífuga de bancada superior com rotores que podem ser fechados para evitar aerossóis.</li>
	<li>Remover o CD4 enriquecido+ camada de células através da interface usando uma pipeta Pasteur. Nota: A camada de células enriquecido será semelhante a um padrão "buffy coat" de células brancas de nublado, mas como só CD4+ células estão presentes, naturalmente será menor e mais difícil de ver.</li>
	<li>Adicionar 2% FBS/PBS para o CD4 células até um volume total de 10 mL e então lave duas vezes com 2% de+ FBS/PBS por centrifugação por 10min a 400 x g durante cada lavagem.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 2% FBS/PBS e contagem das células coradas com um corante vital (azul de trypan) para determinar o número de células e a viabilidade.</li>
	<li>Passo opcional: Resuspenda 5 x 105 a 1 x 106 células em congelamento médio (10% Dimetilsulfóxido na FBS) em alíquotas de 1 mL. Nota: Níveis de alguns marcadores de superfície podem ser alterados por crio-preservação e descongelar. É, portanto, muito importante que todas as amostras são processadas de forma consistente. A fim de minimizar as diferenças nas variáveis analíticas, as amostras foram crio-preservados e em lote para análise neste estudo.</li>
</ol>2. fluxo Cytometry
<ol><li>Descongelar o CD4 criopreservado+ rapidamente as células em um banho de água a 37 ° C e lavagem média de previamente aquecido em uma vez (RPMI 1640 + L-glutamina, suplementado com 10% FBS e 1x penicilina-estreptomicina).</li>
	<li>Adicionar as células para 9 mL de meio, centrifugar durante 5 min à 400 x g e remover o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1% albumina de soro bovino (BSA) em PBS (50 µ l) para que cada uma condição a ser testado usa entre 5 x 10,5 e 1 x 106 células.</li>
	<li>Misture as células com coloração Buffer (50 µ l). Nota: Brilhante mancha Buffer impede vários artefactos de coloração que podem interferir com a análise dos dados, quando dois ou mais BV ou compre as manchas são utilizadas simultaneamente devido às propriedades químicas inerentes destes corantes. Em condições simples ou inocente, a 50 µ l de tampão de mancha brilhante pode ser substituído por 50 µ l de 1% BSA/PBS.</li>
	<li>Adicionar os anticorpos às células (de acordo com o "volume usados" coluna na tabela 1) e incubar no gelo no escuro por 30 min.</li>
	<li>Lavar as células duas vezes em 1% BSA/PBS por centrifugação por 3 min a 600 x g durante cada lavagem.</li>
	<li>Resuspenda em 1% BSA/PBS (400 µ l) e transferir para um tubo de aquisição de citometria de fluxo.</li>
	<li>Vórtice as células suavemente antes de adquirir dados sobre um citômetro de fluxo:</li>
</ol>3. set-up e controles de citometria de fluxo
<ol><li>Usando um exemplo imaculado, conjunto fotodiodo tensões para que os linfócitos podem ser separados de detritos óbvio e células mortas (eventos com área de dispersão (SSC) lado de alta e baixa dispersão para a frente (FSC))16. Usando amostras coradas única, defina fotomultiplicador tensões (PMT) para que fluorescência positiva pode ser discernida de fluorescência de fundo enquanto se certificar de que todos os eventos estão dentro da escala detectável. Nota: Uma melhoria seria a trama CV contra tensão de PGTO para cada PMT usando grânulos palidamente fluorescentes para encontrar a tensão mínima para resolução ideal (o "Pico 2" método19).</li>
	<li>Conta para sobreposição espectral, gerando uma matriz de compensação usando manchas única com grânulos de captura. Adicionar contas de compensação comercialmente disponíveis (60 µ l) e grânulos de controlo negativo (60 µ l) a 1% BSA/PBS (100 µ l) e o vórtice. Nota: Os grânulos de captura usados devem coincidir com as espécies de hospedeiros e IgG isotipo do anticorpo sendo usado. A matriz de compensação deve ser re-calculada se o número de lote do qualquer tandem tinge as alterações, como podem exibir considerável variabilidade em seus espectros de emissão entre lotes.</li>
	<li>Adicione um único anticorpo (20 µ l) e o vórtice.</li>
	<li>Incube a temperatura ambiente no escuro por 30 min.</li>
	<li>Centrifugar a 200 x g durante 10 minutos e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda em 1%BSA/PBS (500 µ l) e vortex.</li>
	<li>Adquirir a amostra com um citômetro de fluxo, usando o gerador de matriz designado compensação do software de aquisição de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Use controles de FMO para orientar a colocação de portões para fluorescência de marcador positivo contabilizar derramamento de corante, que é a principal fonte de fluorescência de fundo em experimentos usando ≥4 cores16. Siga a coloração geral do pilha-superfície de protocolo conforme descrito na etapa 3, mas para cada condição, omitir um do fluorophores da etapa de coloração (onde CD45RA for omitido, também omitir a mancha ao vivo/morto). Adquira 100.000 linfócitos para cada condição.</li>
	<li>Defina a positividade de portão no ≤ 0.5% das células. Consulte a Figura 2 para obter um exemplo ilustrado de FMO controles.</li>
</ol>4. análise de dados
<ol><li>Emprega o software de aquisição do citômetro de fluxo para definir um limite de 5.000 unidades no parâmetro FSC para excluir muito pequenos detritos.</li>
	<li>Usar um portão parar para adquirir 10.000 células cTfh (CD4+ CD45RA– CXCR5+). Nota: O usuário individual pode recolher mais de 10.000 células. Este número foi um compromisso entre coletando células suficientes para fornecer resultados significativos e ao tempo despendido para a coleção.</li>
	<li>Usando uma área de FSC / SSC-área ponto enredo, desenhar uma elipse ou polígono portão para selecionar a população de linfócitos, excluindo-se os restos e células abertamente morto (eventos com um SSC-área alta e baixa FSC-área).</li>
	<li>Usando uma área de FSC / trama do ponto de FSC-largura, desenhar um polígono portão para selecionar células únicas excluindo parelhas (parelhas tem uma área maior mas largura semelhante de células únicas).</li>
	<li>Usando uma área de FSC / marcador CD45RA e viabilidade ponto enredo, desenhar um portão Retangular para selecionar ao vivo, CD45RA– (células com uma baixa fluorescência para esse marcador).</li>
	<li>Usando uma área de FSC / CD4 ponto enredo, desenhar um portão Retangular para selecionar CD4+ (células com uma alta fluorescência para esse marcador).</li>
	<li>Usando um CD4 / CXCR5 ponto enredo, desenhar um portão Retangular para selecionar CXCR5+ (i.e., cTfh) (células com uma alta fluorescência para esse marcador).</li>
	<li>Usando um CXCR3 / trama do ponto de CCR6, lugar um quad portão de subdividir as células cTfh em cTfh1, 2 e 17 células (que são altos e baixos para cada marcador). Nota: As células com o fenótipo CD4+ CXCR5+ CXCR3+ CCR6+ são mal caracterizada. Chamamos estas células de cTfh1/1718 porque convencional auxiliar as células T (CD4+ CXCR5–) que estão fazendo a transição entre Th17 e Th1 mostrar expressão de CXCR3 e CCR6 e têm sido descritos como cTfh1/1719.</li>
	<li>Usando um histograma de PD-1, use a ferramenta de escala para subdividir as células cTfh (ou se preferirem, o cTfh1 individual, 2, 17 ou 1/17 subconjuntos) em PD-1-/ + ou Oi populações. Nota: A distinção entre PD-1+ e PD-1Oi não é bem definida na literatura. O limite foi definido como a mesma intensidade de PD-1 necessária para detectar Tfh genuíno em suspensões de linfócitos humanos tonsila usando citometria de fluxo com o mesmo painel de anticorpos. Alternativamente, um marcador para ICOS pode ser adicionado ao painel de anticorpos, como apenas PD1Oi células são ICOS+.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Helper+T+Cells.">Follicular Helper T Cells.</a> Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).</li><li>Nurieva, R. 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T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+PD-1+controls+follicular+regulatory+T+cells+in+the+lymph+nodes+and+blood.">The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood.</a> Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).</li><li>Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+T+follicular+regulatory+and+helper+cells+have+memory-like+properties.">Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).</li><li>Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+TFH+Cell+Function+and+Increased+TFR+Cells+Contribute+to+Defective+Antibody+Production+in+Aging.">Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging.</a> Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).</li><li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+CD127low/-+T+Cells:+A+More+Specific+Treg+Population+in+Human+Peripheral+Blood.">CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood.</a> Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo representa uma forma simples e eficiente para analisar as células de cTfh de sangue periférico, permitindo a detecção de todos os subconjuntos relevantes identificados na literatura, até agora. Amostras de sangue podem ser facilmente e eficientemente obtidas como parte do padrão Clínicas ambulatoriais e seriais amostras pode ser coletada em paralelo com os dados clínicos. Por sua vez, isso permite que estudos prospectivos avaliando cTfh subconjuntos como biomarcadores para progressão da doença ou...

Células T-foliculares de auxiliar (Tfh) são um CD4+ subconjunto de células T que caracterizou-se inicialmente em tecidos linfoides1. Estas células expressam PD-1 e receptores de superfície CXCR5, secretam IL-21 e IL-4 e mostram expressão nuclear do fator de transcrição, BCL-62,3. Como seu nome sugere, eles são encontrados em centros germinativos e são essenciais para anticorpos de afinidade elevada produção1.
Dysregulated Tfh respostas têm sido implicadas na patogênese da doença, mais notavelmente a doença auto-imune, onde eles promovem a expansão de células auto-reativas B4. Eles também desempenham um papel no microambiente do tumor do sólido5,6 e cancros linfoides7. Por outro lado, defeitos genéticos de superfície proteínas essenciais para Tfh função como resultado de costimulator (ICOS) células T inducible em síndromes de imunodeficiência humana8. CD4+ CXCR5+ células no sangue periférico humano são denominadas células helper T-foliculares (cTfh) de circulação e são acreditadas para ser o compartimento de memória das células Tfh em tecidos9. O objetivo do método descrito aqui é a análise de subconjuntos de cTfh seguindo CD4+ isolamento de amostras de sangue periférico de células.
Foram definidos vários subconjuntos de cTfh e a eficiência com que fornecem ajuda células B difere de um subconjunto para mais9,10,11,12. As proporções relativas destes subconjuntos são alteradas em uma série de doenças, mais proeminentemente auto-imune em que lá é quase sempre um aumento relativo no mais funcional PD-1+ / Oi e/ou subconjuntos de cTfh2 ou cTfh17 em comparação com os menos funcional PD-1– e/ou subconjuntos de cTfh112. A extensão dessas mudanças frequentemente associar com parâmetros clínicos, incluindo títulos de atividade e auto-anticorpos doença, indicando um papel potencial de distribuição de subconjunto cTfh como biomarcador prognóstico na doença, que pode refletir a atividade da ESF no tecidos linfoides9,12,13,14. Além disso, recolhendo amostras de sangue dos participantes é rápido, seguro e aceitável e então permite serial de monitoramento para a análise da progressão da doença ou resposta à terapia.
O uso de CD4 isolado+ de células T sobre suspensões de células mononucleares (PBMNC) de sangue periférico tradicional permite maiores experiências de citometria de fluxo da produção, reduzindo o tempo necessário para adquirir um número considerável de células de cTfh para análise. Isto é particularmente útil quando a classificação de células de cTfh rara subconjuntos usando fluxo ativado celular classificação (FACS). Para auxiliar a eficiência, estas suspensões podem ser criopreservadas para habilitar "lotes" de amostras a ser usado no experimento de citometria de fluxo. Em testes, o CD4+ pureza não foi reduzida em criopreservação.
Enquanto laboratórios diferentes usados diferentes marcadores para classificar cTfh células nos estágios iniciais de sua descoberta, o método apresentaram aqui faz uso de um regime unificado de dois grupos de marcadores de superfície celular como proposto por Schmidt et al.12, 15 para permitir a identificação simultânea de cTfh e seus subconjuntos reconhecidos nove em um único fluxo cytometry experimentar.
Como são usados apenas marcadores de superfície celular, as células não necessitam de fixação ou permeabilização e assim podem permanecer vivas para estudos funcionais a jusante. Isto poderia ser facilitado pela célula classificação usando FACS com o mesmo painel de anticorpos. Este painel pode ser expandido para incluir outros marcadores, permitindo as restrições do citômetro de fluxo sendo usado.
A análise das experiências de citometria de fluxo multi cor pode ser um desafio devido à natureza inerentemente subjetiva de gating em lotes do ponto 2-dimensional, especialmente quando populações de células não têm uma distribuição clara bi-modal na fluorescência do marcador, como é o caso para células cTfh e seus subconjuntos. Por esta razão, é imperativo para configurar os controles eficazes para reduzir os artefatos para permitir melhor resolução das populações e para definir a retenção de estratégias com confiança. Como tal, design de painel de anticorpos e a instalação de controles básicos para um fluxo cytometry experimentar, ou seja, usando a compensação e FMO controles estão descritas no passo 3.4.2 e 3.4.3,respectively.
Todas as células cTfh são definidas como CD4+ CXCR5+ CD45RA–. O nível de expressão do marcador característico de ativação Tfh PD-1 então pode ser determinado para identificar os subconjuntos do PD-1-, PD-1+ ou PD-1Oi cTfh células. Em seguida, usando uma combinação dos receptors do chemokine CXCR3 e CCR6, que são diferencialmente expressos pelo tradicional Th1, 2 ou 17 células, cTfh podem ser caracterizado como cTfh1, 2 ou 17-como por um perfil de CXCR3+ CCR6-, CXCR3– CCR6- e CXCR3– CCR6+, respectivamente.
O painel de anticorpos usado por nosso laboratório é exibido na tabela 1. O usuário pode ter para se adaptar a sua seleção de fluoróforo para contabilizar o laser e a configuração do filtro de luz disponível na sua citômetro de fluxo local.
As considerações a seguir influenciam a escolha de fluorophores. Sempre que possível, use fluorophores brilhante. Em particular, use o mais brilhante fluorophores disponível sobre as divisões mais marcadores (menos altamente expressas). Marcadores de redutor incluem PD-1, CXCR3 e CCR6 e em menor medida, CXCR5. Fizemos especificamente empreg o novo BB, BV e BUV fluorophores que proporcionam excelente brilho e assim permitir mais fácil resolução de populações distintas das células.
A seleção de fluoróforo espalharam os espectros de emissão tanto quanto possíveis minimizar a sobreposição espectral e, portanto, o nível de compensação pedida. Uma ferramenta online gratuita que pode ser usada para auxiliar a criação de um painel de citometria de fluxo pode ser encontrada aqui: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Para economizar espaço no espectro de emissão, utilizamos um "canal de despejo" usando um corante de viabilidade com um comprimento de onda de emissão que se sobrepõe com os da APC-H7 (conjugados para CD45RA) para habilitar a detecção (e exclusão) de ambos mortos e/ou CD45RA+ usando um único detector.
Aqui, um protocolo é apresentado para o isolamento de sangue periférico CD4+ T-células e sua subsequente análise por citometria de fluxo para determinar as proporções dos diferentes e recentemente descrito subconjuntos de circulação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1037px;" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail</td>
			<td style="width:179px;">STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td style="width:119px;">15062</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BUV395 Mouse Anti-Human CD183&#160;Clone 1C6/CXCR3</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>565223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6)&#160;Clone 11A9</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>563923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185)&#160;Clone&#160;RF8B2</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>562747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BB515 Mouse Anti-Human CD4&#160;Clone &#160;RPA-T4</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>564419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">PE Mouse Anti-Human CD279&#160;Clone MIH4</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen</td>
			<td>557946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone&#160; HI100</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen</td>
			<td>560674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L34973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Brilliant Stain Buffer</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td style="width:179px;">BD CompBead</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FACS Aria II Flow Cytometer</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FACSDiva 6.1.3</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td>643629</td>
			<td>Flow Cytometer Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FlowJo 10.2</td>
			<td style="width:179px;">Treestar Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flow Cytometry Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CXCR3 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">565223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CCR6 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">563923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CXCR5 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">562747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CD4 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">564419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-PD-1 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">557946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CD45RA antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">560674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Viability Marker</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L34973</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cd4+ t-cells and analysis of circulating t-follicular helper (ctfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry

Aberrante atividade das células foliculares-T auxiliar (Tfh) é detectável em doenças auto-imunes e sua presença está associada com desfechos clínicos, quando se analisa o microambiente linfonodal em linfoma de células B não-Hodgkin. Subconjuntos de células T-foliculares auxiliar (cTfh), o compartimento de memória circulantes de células Tfh no sangue, que circula também são perturbados na doença e, portanto, representam potenciais novos biomarcadores preditivos. Teste baseado em sangue periférico é vantajoso porque é relativamente não-invasivo e permite monitoramento serial simples. Este artigo descreve um método para isolar CD4 + T-células do sangue humano e posterior análise por citometria de fluxo para enumerar as células cTfh e as proporções de seus vários subconjuntos (cTfhPD-1-/ + / Oi, cTfh1, 2, 17 e cTfh1/17). O nível destes subconjuntos foi então comparado entre indivíduos normais e pacientes com linfoma. Descobrimos que o método era robusto o suficiente para obter resultados fiáveis de material paciente rotineiramente coletada. A técnica que descrevemos para a análise pode ser facilmente adaptada para celular classificação e aplicações a jusante como RT-PCR.

CD4 alta+ pureza foi conseguida usando o CD4+ protocolo de isolamento, que era de confiança em todas as amostras de sangue testadas por nós (quer dizer: 96,6%, SD: 2.38, n = 31) (Figura 3).
Identificação de cTfh (CD4+ CXCR5+ células) em um assunto normal representativo é apresentado(Figura 4). A proporç...

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Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aqui, um protocolo para o isolamento e caracterização de CD4+ células T subconjuntos do sangue periférico humano é descrito. Purificado CD4+ T-células são analisadas por citometria de fluxo para determinar proporções de subconjuntos de célula auxiliar T-folicular.

Isolamento de CD4+ T-células e análise de circulação folicular-T Helper (cTfh) célula subconjuntos de citometria de fluxo de 6 cores usando o sangue periférico

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Este método pode ajudar a demonstrar as diferenças entre subconjuntos de células auxiliares T-foliculares circulantes em estados saudáveis e doentes. As principais vantagens desta técnica são que é rápido, que as amostras podem ser processadas em lote, e que as células permanecem vivas para análise funcional a jusante. Esta técnica facilita a avaliação dos subconjuntos auxiliares T-foliculares circulantes como biomarcadores para a progressão da doença, pois se correlacionam com marcadores de gravidade clínica. Ajudando na demonstração deste procedimento será a Dra.

isolation-cd4-t-cells-analysis-circulating-t-follicular-helper-ctfh

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

12.0K visualizações.  University of Leicester. Este método pode ajudar a demonstrar as diferenças entre subconjuntos de células auxiliares T-foliculares circulantes em estados saudáveis e doentes. As principais vantagens desta técnica são que é rápido, que as amostras podem ser processadas em lote, e que as células permanecem vivas para análise funcional a jusante. Esta técnica facilita a avaliação dos subconjuntos auxiliares T-foliculares circulantes como biomarcadores para a progressão da doença, pois se correlacionam com...

Vídeo: Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Biologia

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimizado coloração e Proliferação Métodos de Modelagem para Monitoramento Divisão Celular usando Corantes Rastreamento celulares

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Técnicas de Análise de vesículas extracelulares utilizando citometria de fluxo

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Isolamento e caracterização de microvesículas a partir de sangue periférico

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

Medição de Mitophagy sensível pelo repórter fluorescentes Flow Cytometry usando o pH-dependente mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células T por citometria flow

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and extremely large cell (40-60 &#181;m). As opposed to the fast-increasing knowledge in megakaryopoiesis at the cell biology and molecular level, the characterization of megakaryopoiesis by flow cytometry is limited to the identification of mature MKs using lineage-specific surface markers, while earlier MK differentiation stages remain unexplored. Here, we present an immunophenotyping strategy that allows the identification of successive MK differentiation stages, with increasing ploidy status, in human primary sources or in vitro cultures with a panel integrating MK specific and non-specific surface markers. Despite its size and fragility, MKs can be immunophenotyped using the above-mentioned panel and enriched by fluorescence-activated cell sorting under specific conditions of pressure and nozzle diameter. This approach facilitates multi-Omics studies, with the aim to better understand the complexity of megakaryopoiesis and platelet production in humans. A better characterization of megakaryopoiesis may pose fundamental in the diagnosis or prognosis of lineage-related pathologies and malignancy.

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Here, we present an immunophenotyping strategy for the characterization of megakaryocyte differentiation, and show how that strategy allows the sorting of megakaryocytes at different stages with a fluorescence-activated cell sorter. The methodology can be applied to human primary tissues, but also to megakaryocytes generated in culture in vitro.