Este protocolo é um simples ensaio baseado em citometria de fluxo que permite a medição do potencial da membrana mitocondrial e da massa mitocondrial em células vivas. Ensaios metabólicos padrão falham quando se trabalha com populações raras, como as células-tronco hematopoiéticas. Este método permite aos usuários traçar perfis de membrana mitocondrial ao trabalhar com baixo número de células e determinar novos moduladores metabólicos de células como os HSCs.
Além disso, você pode combiná-lo com ensaios funcionais a jusante, como transplante de medula óssea ou ensaios de formação de colônias para determinar a funcionalidade de suas células pós-cultura. Nossa técnica pode ser explorada para a identificação de novas moléculas capazes de melhorar a função HSC no contexto do transplante de medula óssea e recuperação imunológica hematopoiética após terapias ablativas. Como descrito em nosso protocolo, nosso método pode ser usado para avaliar a aptidão metabólica das células T imunes.
É muito importante que as células tenham exposição mínima à luz após a coloração. Além disso, o uso do inibidor da bomba verapamil deve ser incluído para avaliar a contribuição da bomba efflux. No entanto, os usuários devem estar cientes de que verapamil perturba profundamente o equilíbrio iônico e não pode ser usado para avaliar o efeito de um modulador metabólico no potencial da membrana mitocondrial.
A demonstração visual deste método é extremamente importante porque existem algumas etapas críticas que é preciso ter em mente ao trabalhar com baixo número de células, e essas etapas são muitas vezes ausentes nos artigos regulares que os usuários lêem no PubMed. Para a classificação FAC, identifica-se a população LKS, definida pela linhagem negativa, Sca1 positiva, cKit positive. Células-tronco hematopoiéticas de cerca de cinco a 10% das células da população de LKS são identificadas por gating para CD150 positivo, população CD48 negativa, rotulada como HSCs.
Após a triagem de células-tronco hematopoiéticas, centrifugar os tubos a 300 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Remova suavemente a maior parte do supernatante sem desalojar a pelota, e deixe de 50 a 80 microliters em cima da pelota celular. Resuspend a pelota celular em meio de expansão de células-tronco para um volume final de 200 microliters.
Prepare uma cultura de tecido estéril tratada 96 placas de poço de fundo U, e identifique os poços onde as células serão cultivadas. Transfira 100 microliters de 2x meio basal previamente preparados nestes poços. No NR marcado bem, adicione dois microliters de uma solução riboside de nicotinamida de 100x.
Transfira 100 microliters de meio basal 2x em poços para controle de manchas. Semente 100 microliters de células-tronco hematopoiéticas preparadas em cima dos poços contendo meio basal 2x. Sementes 100 microliters de células inteiras de medula óssea em poços marcados como controles de coloração.
Adicione 200 microliters de água autoclavada em todos os poços circundantes para reduzir a evaporação de poços que contêm células. Coloque a placa intacta em uma incubadora a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 72 horas. Pegue a placa para repor nicotinamida riboside a cada 24 horas, e coloque-a de volta na incubadora.
Ao final do período de cultura, adicione dois microliters de solução 100x TMRM e dois microliters de solução de mancha fluorescente verde de 100x em cada um dos poços de teste. Adicione dois microliters de 100x TMRM no controle de coloração TMRM. Adicione dois microliters de 100x mancha fluorescente verde no poço de controle de manchas MitoTracker.
Cubra a parte superior da placa com papel alumínio. e coloque a placa de volta em uma incubadora a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 45 minutos. Retire a placa da incubadora e centrífugue a 300 vezes g durante cinco minutos.
Inverta a placa para remover o supernascer e adicione 200 microliters de buffer FACS padrão para resuspend. Cubra a placa com papel alumínio. Centrifugar a placa a 300 vezes g por cinco minutos.
Repita esta etapa de lavagem três vezes. Resuspense as células em 200 microliters de tampão FACS e transfira para tubos FACS. Para executar as amostras no citómetro de fluxo, primeiro carregue os controles de cor única na máquina e grave pelo menos 5.000 eventos em cada um por um.
No software, pressione Adquira e, em seguida, grave no painel para adquirir e gravar controles de cores únicas. Pressione a configuração de compensação e clique em Calcular Compensação para calcular a compensação. Uma vez aplicada a compensação, adquira a amostra hematopoiética das células-tronco e registe o maior número possível de eventos.
Exporte os arquivos FACS do ítmetro e abra o arquivo no software de análise. No FlowJo, use dispersão para a frente e dispersão lateral para identificar a população celular. Identifique singlets nos portões seguintes e, em seguida, plote a fração negativa da DAPI representando células vivas.
No portão de cela ao vivo, faça um gráfico de contorno no TMRM e canal de manchas fluorescentes verdes para medir o potencial e a massa da membrana mitocondrial, respectivamente. Exporte a intensidade média de fluorescência desses dois canais no portão de cela ao vivo. Em seguida, exporte a proporção de células no portão baixo TMRM em todas as amostras.
O tratamento de nicotinamida ribosídeo mostrou um claro aumento na baixa população do TMRM. Também aumentou significativamente a proporção de células no portão baixo TMRM e mostrou uma redução significativa da intensidade de fluorescência TMRM. A massa mitocondrial não mudou após a suplementação riboside nicotinamida.
Além disso, a coloração do marcador de células-tronco foi combinada com a coloração mitocondrial pós-cultura. Com a estratégia de gating para identificar células-tronco hematopoiéticas, a exposição à nicotinamida riboside mostrou um aumento significativo na baixa população TMRM e uma diminuição significativa na intensidade de fluorescência TMRM em HSCs fechados. O sinal verde da mancha mitocondrial fluorescente permaneceu inalterado nas duas condições.
É importante cobrir a placa de coloração com papel alumínio, a fim de minimizar a exposição da luz a amostras manchadas. Este método pode ser combinado com ensaios a jusante, como transplante de medula óssea e ensaios de formação de colônias para determinar a funcionalidade de suas células-tronco. Assim, esta técnica permite um método simples de triagem para a identificação de novos moduladores metabólicos de HSCs.
