Este protocolo pode ser utilizado para testar o efeito de múltiplas enzimas de glicossylation no perfil glico de uma proteína alvo e contribuir para uma melhor compreensão das funcionalidades da enzima. A natureza do protocolo permite a triagem de enzimas de glicosylation de forma transitória, mas de alto rendimento. Perfis de glicossylation alterados podem levar a melhores atividades de anticorpos e, portanto, aumentar a eficácia do produto final.
As empresas biofarmacêuticas monitoram de perto a glicosylation como um atributo crítico de qualidade. Uma glicossylation aberrante é uma marca registrada de doenças como o câncer. Portanto, esse método é relevante para a pesquisa farmacológica e biomédica.
O protocolo pressupõe que os usuários tenham experiência em várias técnicas experimentais, incluindo transfecção celular de mamíferos e manchas ocidentais. É melhor começar com menos amostras e usar pontos de parada em primeira instância. Comece avaliando a densidade e viabilidade das células do ovário do hamster chinês.
Em seguida, limpe cuidadosamente o armário de biossegurança e todos os equipamentos com 70% de etanol e uma solução inibidora de RNase para evitar contaminação. Em seguida, pelota as células a 100 vezes G por cinco minutos e resuspensá-las em um meio pré-aquecido a uma densidade celular de cinco vezes 10 para as seis células por mililitro. Transfira oito microliters da mistura mestre DsiRNA ou controle para um cuvette de eletroporação estéril.
Adicione 800 microlitros da suspensão celular ao mesmo cuvette, misture e entregue o pulso de eletroporação. Em seguida, transfira a suspensão celular da cuvette para um poço de uma placa de seis poços, evitando material semelhante a espuma. Incubar as células por 10 minutos sem tremer.
Após a incubação, adicione 800 microliters de mídia pré-aquecida para fazer um volume final de 1,6 mililitros por poço. Cresça as células transfeinadas na incubadora enquanto treme a 150 RPM. Depois de 48 horas, colmeia o sobrenante e as células.
Após a purificação do IgG, adicione a elução A em um concentrador centrífugo de corte de peso molecular de três quilodalton, e centrífuga a 13.300 vezes G por 40 a 50 minutos a quatro graus Celsius. A centrifugação é completa quando o volume residual é igual ou inferior a 50 microliters. Descarte o fluxo-through e adicione 500 microliters de PBS 1X pré-refrigerado para diluir o sobrenatário residual.
Centrifugar a amostra novamente usando as mesmas condições até 50 microlitres de restos residuais de sobrenascer. Para obter uma diluição de 100X do supernante, adicione 500 microliters de PBS 1X pré-refrigerado e repita o processo de centrifugação. Concentre o supernascimento em uma concentração final de aproximadamente 2,5 gramas por litro em 40 microliters para garantir a compatibilidade com o método de análise glicano.
Para análise glican, transfira 200 microliters da solução de contas magnéticas para um tubo PCR de 2 mililitros. Coloque-o no suporte magnético para separar as contas do sobrenatante e remova o sobrenatante cuidadosamente. Em seguida, remova os tubos do suporte magnético e adicione a amostra de proteína purificada e o vórtice.
Em seguida, adicione o tampão de desnaturação de alimentação ao tubo de amostra e incubar por oito minutos a 60 graus Celsius. Mantenha os tubos de amostra abertos para um desempenho de reação ideal. Após a incubação, adicione PNGase F e incubar por mais 20 minutos a 60 graus Celsius para cortar glycans dos anticorpos purificados.
Após a liberação de N-glicanos, feche o tubo de amostra e o vórtice. Em seguida, adicione acetonitrilo ao tubo de amostra, vórtice e incubar à temperatura ambiente por um minuto. Coloque os tubos de amostra no suporte magnético para separar as contas da solução.
Em seguida, usando uma pipeta, remova cuidadosamente o sobrenatante sem tocar nas contas. Adicione a solução de rotulagem glican contendo fluorofora à amostra em um capô de fumaça e misture por vórtice. Após uma incubação de 20 minutos a 60 graus Celsius com tampas abertas, remova o excesso de corante lavando a amostra três vezes em acetonitrilo.
Em seguida, elute os glicanos rotulados em água duplamente destilada. Coloque o tubo de amostra no suporte magnético e colete o supernacido enriquecido com glícanos purificados e rotulados. Em seguida, prepare e carregue todas as normas e amostras necessárias nas posições da bandeja designadas.
Execute o protocolo de análise glican e analise e identifique os glicanos presentes na amostra usando software apropriado. A análise de manchas ocidentais mostrou redução da expressão proteica Fut8 em células transfeinadas com uma mistura de três construções de DsiRNA Fut8. Estruturas glicanas das células de knockdown também apresentaram diminuição da fucosylation.
Essa tendência foi mais acentuada em estruturas agalactosylated e observada em menor grau em estruturas galactosylated. Uma redução de duas vezes na fucosylação do núcleo foi observada a partir da eletroporação usando dois pulsos de onda quadrada em comparação com um único pulso de onda quadrada sem diferenças significativas na viabilidade celular. No geral, o aumento da concentração de RNA de interferência curta tem uma grande interferência na fucosylation do núcleo do que o aumento do tempo de colheita.
A relação entre água e acetonitrilo determina se os glicanos estão em solução ou parte das contas. Isso é crucial para ser lembrado durante as etapas de lavagem para evitar a remoção acidental dos glicocanos rotulados da solução. Um experimento de acompanhamento pode envolver a caracterização de anticorpos monoclonais purificados usando ensaios baseados em células para quantificar a citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos e citotoxicidade dependente de complementos.
