Este método pode ajudar a responder algumas das questões importantes no campo da fabricação de processos bios sobre aspectos da caracterização da linha celular e mediar e otimizar processos. As vantagens dessa técnica são que ela fornece maior controle em frascos de shake e permite a automação e o desempenho de um grande número de estudos em pequena escala para rápida geração de dados. Demonstrando o procedimento, Sai Rashmika Velugula e Casey Kohnhorst, pesquisadores do meu laboratório.
Comece imergindo um estoque vil de três vezes 10 a o sétimo show células por mililitro de meio congelante em um banho de água de 37 graus Celsius. Quando apenas uma pequena lasca de gelo permanecer, incruste suavemente a suspensão celular rapidamente descongelada algumas vezes e transfira um mililitro de células para um frasco de shake ventilado de 125 mililitros contendo 29 mililitros do meio OptiCHO. Coloque o frasco em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius e 8%de CO2 com sacudindo-o 130 RPM.
Subculturando as células após 72 horas em 100 mililitros de médio Celsius fresco de 37 graus Celsius em um frasco rotador de 125 mililitros para outra incubação de 72 horas a 37 graus Celsius e 8%DE CO2 com agitação a 70 RPM. No terceiro dia de subcultura, adicione um meio pré-aquecido fresco ao frasco rotador para manter as células em uma viabilidade de pelo menos 90% para uma última 24 horas de cultura. Na manhã seguinte, clique no ícone remoto da área de trabalho e clique em conectar.
Quando a área de trabalho remota estiver conectada, abra o software do contador de células e instale um novo Reagent Pak. Em seguida, esvazie o lixo trypan azul e prime o sistema. Em seguida, minimize a conexão remota e abra o software do micro reator bio usando um experimento existente como modelo para criar um novo experimento.
Antes de iniciar uma corrida, defina as placas usadas durante a execução na seção de imitação do software e coloque 12 vasos de cultura estéreis em cada estação de cultura. Coloque placas de fixação autoclavadas em cima dos vasos e coloque as placas de mexida em cima das placas de fixação certificando-se de que cada pino está inserido com segurança. Em seguida, fixe as placas de fixação com os parafusos e nobs fornecidos.
Para iniciar o sistema, digitalize o código de barras fornecido com cada vaso cultural. O sistema inicializará e verificará a presença dos navios apropriados. Coloque o controle de temperatura em 37 graus Celsius e a agitação para 1.000 RPM e ligue o monitor PH de oxigênio dissolvido.
Em seguida, execute o programa de carregamento médio. Quando todo o meio tiver sido carregado, 35 microliters de EX-CELL Antifoam serão adicionados da placa Antifoam aos vasos culturais. Após 30 minutos começar a registrar o oxigênio dissolvido e PH dentro dos meios de cultura, permitindo que o oxigênio dissolvido atinja um ponto de 50% após o equilíbrio de oxigênio dissolvido, ligue as adições de base de fundo para atingir um ponto de 7,1 PH para todos os vasos culturais.
Na manhã seguinte, execute a etapa PH pausada e transfira todo o conteúdo do frasco rotador para um tubo cônico de 250 mililitros estéril para centrifugação. Resuspenque a pelota em meio fresco suficiente para que a densidade final seja de uma vez 10 a sexta células CHO por mililitro depois de adicionar o inóculo aos vasos de cultura e adicionar as células suspensas nos poços apropriados de uma placa de poço estéril de 24 poços. Adicione três mililitros de inóculo a cada poço e coloque a placa inóculo na mesa designada dentro do capô.
Em seguida, deixe os vasos de cultura se equilibrarem por pelo menos uma hora e iniciem a etapa de contagem de cinco EX-CELL no programa. Para análise diária de nutrientes e metabólitos no segundo dia coloque as placas do suporte do tubo de amostra em seus decks designados e carregue tubos de microcentrifuuge abertos nos suportes apropriados. Em seguida, coloque as amostras na bandeja do analisador, para realizar a análise de nutrientes.
Para terminar a corrida, desligue o controle de temperatura seguido da agitação. Pare o controle de PH de oxigênio dissolvido e as adições da base de fundo, todos os outros controles e o monitor do sistema. Desaparafusar o grampo e mexer as placas, remover os vasos de cultura e enroscar as placas de secagem na estação de cultura.
Em seguida, execute o ciclo de secagem de duas horas no programa;clicando em parar no software bioreator uma vez que o ciclo de secagem tenha terminado. Para colher as células, transfira o fluido de cultura celular dos vasos do reator para tubos cônicos correspondentes para centrifugação e filtrar os supernantes através de filtros PVDH estéreis de 0,22 micrômetros. Em seguida, transfira um mililitro de cada cultura celular estéril supernacido em tubos individuais de microcentrífugo de 1,5 mililitro para armazenamento negativo de 20 graus Celsius até a análise de titer.
Para medir os títulos IgG das amostras, primeiro ligue o sistema biosensor de auxílio à proteína. Depois que a lâmpada tiver aquecido por pelo menos uma hora, permita que as amostras se equilibrem à temperatura ambiente e pré-ak uma ponta de auxílio proteico por amostra em meio de células frescas por pelo menos 30 minutos. Em seguida, coloque a temperatura da placa em 26 graus Celsius.
Carregue as amostras no sistema e execute o ensaio usando o ensaio padrão de alta sensibilidade com regeneração no software de aquisição de dados. Utilizando o contador celular integrado, as densidades e viabilidades celulares viáveis médias podem ser obtidas diariamente para todas as condições culturais. Utilizando o analisador de nutrientes também podemos obter os perfis de nutrientes e subprodutos demonstrando a viabilidade de monitorar esses atributos no sistema de reator microbio.
Além disso, a produtividade total das culturas celulares sob as várias condições culturais de interesse pode ser quantificada usando o sistema biosensor de auxílio proteico, como demonstrado. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar que o protocolo só funciona se a programação for feita corretamente;garantindo a execução oportuna das etapas do protocolo com erros mínimos. Seguindo este procedimento, outros métodos como: cromatografia líquida, espectrometria de massa e dispersão de luz multi-ângulos podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre as propriedades físicas e químicas do produto fabricado.
