As estratégias atuais para uma triagem de medicamentos de urina são caras para serem realizadas para análise de rotina de painéis cada vez maiores de drogas de abuso, conforme necessário para testes no local de trabalho, bem como aplicações terapêuticas de monitoramento de medicamentos. Além disso, métodos baseados em ensaios de amino são propensos a viés e são, em última análise, limitados à análise de alvos de painéis de drogas conhecidos. A principal vantagem do nosso método, que é chamado de MSI-CE-MS, é que ele permite a triagem rápida de um painel de drogas ilimitado e seus metabólitos com alta precisão e mínimo de trabalho amostral.
Há uma necessidade urgente de um método de triagem de alto rendimento e acessível para melhorar os resultados dos pacientes, confirmando a adesão e otimizando os regimes de dosagem de medicamentos, ao mesmo tempo em que revela o uso de drogas ilícitas. Esta plataforma de separação multiplexada pode ser aplicada a uma variedade de outras áreas de pesquisa relacionadas ao perfil metabólico direcionado ou não-direcionado em amostras biológicas complexas. Comece descongelando amostras de urina matinais desidentidas coletadas de pacientes com um histórico de medicamentos prescritos por menos 80 graus Celsius armazenados no gelo e vórtices das amostras descongeladas por 30 segundos.
Em seguida, sedimente as amostras por centrifugação e combine três alíquotas de 10 microliteres de cada amostra com 10 microlitros de padrões internos deuterados, cinco microlitros de uma solução de 4-fluoro-L-fenillanina e 3-cloro-L-tyrosine e 25 microlitros de água deionizada. Em seguida, centrifufique as misturas por um minuto e transfira 20 microliters de cada amostra em frascos individuais de polipropileno. Para definir os parâmetros de condicionamento capilar de sílica fundido não revestidos, corte um 135 centímetros de comprimento, 50 micrômetros de diâmetro interno e 360 micrômetros de diâmetro externo capilar de um carretel.
Use um fabricante de janelas capilar para remover cerca de 7 milímetros de revestimento de poliamida de ambas as extremidades de cada capilar. Em seguida, instale as entradas capilares na eletroforese capilar, ou cartucho CE, ao enrolar cada capilar por duas curvas de 360 graus, tomando o cuidado de protuberar cerca de dois milímetros das saídas capilares da agulha do pulverizador CE. Quando todos os capilares tiverem sido instalados, carregue cuidadosamente o cartucho CE no sistema CE e armazene o pulverizador CE da fonte de íons.
Coloque a cromatografia líquida, ou pulverizador LC, na fonte de íons e selecione a descarga no software do sistema para configurar o condicionamento capilar. Ajuste a duração do metanol, um hidróxido de sódio molar, água desionizada e descarga de eletrólito de fundo a 30 minutos por descarga e coloque a bomba isocrática em espera durante o período de condicionamento capilar. Após a última descarga, limpe o espectrômetro de massa de eletroforese capilar, ou pulverizador CE-MS, e o eletrodo CE com lenços encharcados de metanol.
Limpe a interface CE-MS com uma solução de água isopropanol de um para um para remover quaisquer depósitos residuais de sal. Substitua o pulverizador LC pelo pulverizador CE-MS limpo e um capilar recém-condicionado na interface líquida coaxial. Em seguida, ligue a bomba isocrática e aplique uma tensão de 30 quilovolts por 15 minutos para garantir que um perfil estável de corrente CE seja alcançado antes da análise da urina.
No software do sistema, selecione o pré-condicionamento, defina a descarga para 600 segundos e especifique uma posição de arquivo eletrólito de fundo. Ajuste a injeção para injetar hidrodinamicamente as amostras a 100 milibares por cinco segundos e para injetar eletrokinetticamente os espaçadores eletrólitos de fundo a 30 kilovolts por 75 segundos. Coloque a tensão aplicada em 30 quilovolts, a temperatura do cartucho até 25 graus Celsius e o tempo total de execução para 40 minutos.
Em seguida, usando o cronograma, aplique um gradiente de pressão de dois milibares por minuto de zero a 40 minutos durante a separação. Quando a aquisição da amostra estiver completa, enxágue o capilar a 50 milibaras de pressão com os eletrólitos de fundo durante a noite enquanto o capilar está no pulverizador CE na fonte de íons. Defina a detecção de íons positivos TOF-MS para abranger uma relação massa-carga de 50 a 1.700, com uma taxa de aquisição de dados de 500 milissegundos por espectro, e confirme que tanto o perfil quanto os dados centralóides são armazenados em formato de arquivo D.
Ajuste as condições de ionização de eletrospray para capilar e para as tensões de 2000 volts cada, o gás nebulizador para 10 libras por polegada quadrada, e a entrega de gás de secagem para oito litros por minuto a 300 graus Celsius com um fluxo de gás de baia de 3,5 litros por minuto a 195 graus Celsius durante a aquisição. Em seguida, ajuste as configurações de tensão MS do fragmentador, skimmer e octapole uma frequência de rádio para 120, 65 e 750 volts, respectivamente, e defina os parâmetros de controle de instrumentos e aquisição de dados de acordo com o desenho do experimento. Para análise de dados, abra os dados CE-MS multi-segmentos no software do sistema.
Sob cromatografias, defina os dados de extração e os formatos de dados espectrais espectrais de cromatograma e massa para o modo de perfil. Sob suavização, selecione o cúbico quadrático Savitzky-Golay e defina a largura da função para 15 pontos. Em seguida, clique em Integrar MS e defina o integrador como ágil.
Sob filtros de pico, defina o número máximo de picos para 11. Na exibição, clique na lista de picos de integração e selecione o número de pico, o tempo de retenção, a área de pico, a altura do pico e a relação sinal/ruído. Em seguida, salve os parâmetros sob um nome de método único e aplique o método ao processo para a interpretação de cada conjunto de dados.
Nesta análise representativa de várias drogas isobáricas isomeric de abuso e seus metabólitos, foram detectados 30 picos resolvidos de 10 amostras independentes de uma mistura de drogas sem o transporte amostral. Dois outros opioides isobáicos poderiam ser totalmente resolvidos como 20 picos distintos com a aquisição completa de dados de varredura. Da mesma forma, dois isômeros posicionais de anfetamina foram totalmente resolvidos nesta análise ce-ms multi-segmento, para distinguir o abuso ilícito de metanfetamina do potencial uso indevido de fentermina, um estimulante prescrito que é usado como um supressor de apetite para perda de peso.
Nesta análise representativa da triagem de medicamentos, um resultado positivo do teste de triagem para metadona foi deduzido pela detecção de um grande pico de sinal co-migrando com o pico metadona-d3 com um erro de massa baixo. Nenhum outro sinal foi detectado em nenhuma outra amostra de urina no mesmo período e a concentração de metadona detectada excedeu 13 vezes o limite de corte recomendado em comparação com sua razão de resposta de íons medido na amostra e corrigida por um fator de diluição de urina de quatro vezes, confirmando a adesão dos pacientes à terapia de manutenção da metadona. Aqui, uma configuração de injeção serial em CE-MS multi-segmento, compreendendo cinco calibradores de drogas diferentes, foi analisada em duplicata dentro de uma única corrida juntamente com a urina sintética em branco.
Os metabólitos da droga foram detectados como seus íons moleculares potenados acima de seus limites de corte de triagem. Após este procedimento, um grande número de metabólitos polares e iônicos na urina também pode ser analisado pelo MSI CMS em apoio à pesquisa metabólica baseada em descobertas. Além disso, a vigilância abrangente de uma ampla gama de medicamentos exógenos e seus metabólitos pode ser alcançada, incluindo medicamentos não prescritos e drogas ilícitas propensas ao abuso.
Este método otimizado também pode ser usado para rotineiramente rastrear outras drogas de abuso. Estes podem ser metabólitos de cannabis ou álcool e nosso método também pode diferenciar entre uma matriz de urina sintética ou uma falsa matriz de urina e uma amostra de urina natural, real e autenticamente doada também. Lembre-se de sempre ter cuidado ao trabalhar com fluidos biológicos.
