A triagem de compostos orgânicos menores chamados fragmentos usando cristalografia de raios-X é um método eficiente para identificar moléculas que são pontos de partida para a descoberta de drogas ou desenvolvimento de compostos de ferramentas bioquímicas. A triagem de fragmentos cristalográficos revelou não apenas a identidade, mas também onde e como os fragmentos se ligam na superfície da proteína em estudo. Esta técnica pode ser usada em todos os alvos proteicos bioquímicos ou medicamente relevantes para os quais cristais proteicos adequados podem ser cultivados.
A qualidade dos resultados está intimamente ligada à qualidade do manuseio da amostra. Acreditamos que a seguinte demonstração visual ajudará os pesquisadores a realizar experimentos de alta qualidade. Demonstrando o procedimento estará Tatjana Barthel, pesquisadora de doutorado e doutoranda em meu laboratório.
Para começar, abra o saco da placa de triagem pré-aquecida à temperatura ambiente e, em seguida, remova a tampa e a folha da placa de triagem. Decante a solução de imersão de cinco mililitros no reservatório do reagente. Em seguida, encha cada um dos 96 reservatórios da placa com 40 microliters de solução de imersão usando uma pipeta de 12 canais.
Coloque o quadro de fácil acesso em cima da placa de triagem e fixe-o com os grampos incluídos deslizando-os para o lado esquerdo e direito do dispositivo. Coloque a placa de triagem e o quadro de fácil acesso sob o microscópio e deslize aberto o primeiro poço movendo o respectivo azulejo de vidro acrílico da moldura. Adicione 0,4 microliters de solução de imersão do reservatório ao fragmento que contém bem usando uma ponta de pipeta fresca.
Certifique-se de que a gota cubra o fragmento seco. Coloque a placa de cristalização que contém os maiores cristais sob o segundo microscópio e abra a folha de vedação em um dos poços. Usando um laço de tamanho apropriado, transfira um cristal para o poço da placa de triagem sob o primeiro microscópio.
Lave o laço na placa de vidro preparada e seque-a suavemente tocando-a suavemente no tecido. Faça isso após cada transferência para evitar contaminação cruzada. Use o microscópio para garantir que o cristal tenha sido colocado corretamente.
Repita o procedimento para o segundo cristal. Passe para o próximo poço, e repita o procedimento para todos os poços restantes. Depois que os cristais tiverem sido transferidos para todos os 96 poços da placa de triagem, remova a placa de triagem juntamente com o quadro de fácil acesso sob o microscópio e coloque-a no banco ou na mesa.
Em seguida, remova o quadro de fácil acesso da placa de triagem, sele a placa de triagem com papel alumínio de vedação e coloque-a na incubadora ou armário de cristalização para incubar para o tempo de imersão previamente otimizado. Duas horas de incubação são suficientes, mas durante a noite pode ser mais conveniente. Prepare a espuma Unipuck Dewar com três tampas Unipuck e encha-a com nitrogênio líquido, mantendo-a no chão.
Mova o Dewar meio cheio para o banco, e preencha-o completamente para a borda. Mantenha-o preenchido até a borda superior durante todo o experimento, e substitua o nitrogênio líquido com frequência. Recupere a placa de triagem da incubadora e remova sua folha.
Coloque o quadro de fácil acesso em cima. Deslize aberto o primeiro poço. Colher um cristal da gota e resfriá-lo em nitrogênio líquido mergulhando com um movimento vertical rápido.
Insira a amostra na posição adequada do disco e tome notas relevantes na folha de rastreamento da amostra. Repita o procedimento para o segundo cristal. Vá para o próximo poço e repita o posicionamento de outros cristais até que todos os três discos estejam cheios.
Pré-esfrie as bases Unipuck em nitrogênio líquido e adicione-as em cima das tampas. Armazene os Unipucks em rack de armazenamento em um transporte Dewar ou armazenamento Dewar. Mantenha-os em nitrogênio líquido a temperaturas criogênicas até a medição.
Repita o mesmo procedimento de colheita e armazenamento dos cristais em Unipucks para as amostras restantes na placa de triagem. A variabilidade das morfologias cristalinas depois de realizar a imersão do fragmento e a colheita de cristais é mostrada aqui. Mesmo cristais que parecem um pouco deteriorados foram incluídos, pois ainda resultam em dados úteis.
Os dados foram coletados nas linhas de traves 14.1 e 14.2 no síncrotron BESSY II. A coleta de dados de difração foi realizada para cada amostra. Os dados foram analisados utilizando-se o FragMAXapp, com foco na combinação de XDSAPP para processamento, fspipeline para refinamento de estrutura e PenDA para localização de hit.
Isso resultou em 15 acessos ao complexo proteico AR usando uma condição de imersão livre de DMSO. Em uma campanha anterior da tela de entrada F2X contra o mesmo alvo, incluindo DMSO na condição de imersão, 20 acessos foram encontrados. Isso significa que 75% dos hits podem ser identificados se o DMSO for omitido.
Para o sucesso do experimento, é crucial que os cristais sejam manuseados adequadamente e cuidadosamente durante cada etapa do procedimento. A triagem de fragmentos cristalográficos amadureceu para uma técnica amplamente utilizada, que é frequentemente aplicada na academia e na indústria farmacêutica.
