A transformação mediada por agrobacterium é um método fácil para produzir plantas de batata geneticamente modificadas. A fim de entender as funções genéticas específicas e sua contribuição para a fisiologia dos órgãos. A transformação por agrobacterium rhizogenes é uma ferramenta robusta para avaliar rapidamente as raízes do funcionamento genético, pois resultados semelhantes podem ser obtidos pela transformação de tumefaciens de agrobacterium.
Demonstrando este procedimento estarão Sandra Fernandez-Pinan, uma pós-doutora, e Jennifer Lopez, uma aluna do Maste5r do nosso laboratório. Comece cultivando uma única colônia de agrobacterium durante a noite em cinco mililitros de caldo extrato de levedura, ou meio YEB, complementado com antibióticos em um tubo de centrífuga de 50 mililitros a 28 graus Celsius, a 200 rotações por minuto. Para uma transformação de tumefaciens, meça a densidade óptica na manhã seguinte.
Quando a densidade óptica em 600 nanômetros, ou OD 600 atinge 0,6 a um, centrífugas um mililitro da cultura agrobacterium e resuspensam a pelota em um mililitro de meio YEB fresco sem antibióticos. Após a segunda lavagem, resuspenja a pelota em meio YEB fresco sem antibióticos, para a concentração apropriada para obter um OD final 600 de 0,8, e colocar as células bacterianas no gelo. Para a transformação da planta usando A.rizogenes, transfira cuidadosamente uma planta doador de uma cultura média de 2MS para uma placa quadrada de 120 por 120 milímetros, e use uma agulha cirúrgica para injetar três microlitrais de uma cultura A.rhyzogenes para diferentes troncos internos possível.
Em seguida, transfira imediatamente toda a planta para uma nova placa quadrada contendo meio MS sólido, suplementada com acetossiingona de 0,1 milimolar. Depois de colocar uma segunda planta na mesma placa, transformada da mesma maneira, selar a placa com fita cirúrgica, e colocar a placa verticalmente dentro de um armário de crescimento por quatro dias. Transfira a planta para uma placa quadrada com o meio MS complementado com cefotaxime sódio para matar os A.rizogenes e coloque a placa selada verticalmente dentro de um armário de crescimento por quatro dias.
Depois de 10 a 12 dias, novas raízes peluda aparecerão. Sua transformação pode ser confirmada por microscópio estéreo fluorescente. Neste momento, extirpa as raízes nativas de cada planta, e transfira as plantas para uma nova placa quadrada com meio MS, suplementada com sódio cefotaxime para matar os A.rizogenes.
Para obter uma planta composta, deixe as raízes peludas transgênicas crescerem por mais três a quatro semanas no meio ms, suplementada com sódio cefotaxime. Para transformação de plantas usando A.tumefaciens. Corte e coloque uma folha de uma planta de três a quatro semanas de idade em uma placa de petri, e use um bisturi para fazer um a três cortes transversais do centro da folha até as bordas sem cortar os pedaços da folha.
e excluir a petiole. Coloque imediatamente a folha em uma placa de petri contendo 10 mililitros de meio líquido fresco de 2MS, lado abaxial para cima e cubra a placa. Adicione rapidamente 80 microlitadores da cultura A.tumefaciens ao meio líquido e mexa suavemente o meio por um minuto para distribuir homogeneamente a solução bacteriana.
Em seguida, sele cuidadosamente e cubra a placa com papel alumínio para uma incubação de dois dias em uma câmara Celsius de 24 graus. Ao final do período de transformação, transfira as folhas para cima, para o meio indutor indutor insensível, raspado com pinças para uma incubação de uma semana no armário de crescimento. No final da incubação, transfira as folhas, abaxial-side para cima, para o tiro raspado de pinça induzindo o meio, e incubar as folhas em um armário de crescimento.
Quando os paraquedas emergiu têm cerca de dois centímetros de altura, corte três paraquedas emergentes de cada insensível. Coloque até cinco eventos diferentes de transformação de paraquedas em frascos de cultura individual contendo meio MG complementado com sódio cefotaxime para permitir a raiz, e rotule o subconjunto conforme apropriado para uma incubação de três a quatro semanas no armário de crescimento até que as calhas sejam vigorosas. Ao final da incubação, selecione a planta mais vigorosa de cada evento, e corte os segmentos apical da calha com três a quatro internos de cada planta.
Coloque os segmentos em um frasco de cultura contendo meio 2MS suplementado com sódio cefotaxime e plante as plantas até que desenvolvam calhas e raízes vigorosas. Para realizar um ensaio genético de repórter histoquímico beta-glucuronidase ou GUS histoquímico, fixar as raízes de uma cultura de plantas in vitro de duas a três semanas com acetona 90% refrigerada por 20 minutos no gelo. No final da fixação, lave as raízes duas vezes em água destilada e trate as raízes com uma solução fresca de coloração GUS sob vácuo por 20 minutos.
No final do tratamento a vácuo, coloque as raízes a 37 graus Celsius no escuro por cerca de quatro horas. Quando uma cor azul é visível, lave as raízes duas vezes com 70% de etanol, e visualize a mancha sob um microscópio de campo brilhante. Raízes peludas transformadas exibem uma florescência vermelha quando iluminadas com luz verde, enquanto o controle negativo agrobacterium não transformado não demonstra tal florescência, indicando a adequação do marcador de transformação vermelha DS para identificar raízes peludas transgênicas.
Aqui, as manchas gus em raízes de plantas transgênicas obtidas por A.tumefaciens e raízes peludas transgênicas obtidas por A.rizogenes são mostradas. Como observado, raízes transformadas com A, tumefaciens e cultivadas in vitro, demonstram manchas azuis na endoderme, uma camada celular entre o córtex e a estela. Em raízes mais desenvolvidas, a rotulagem azul é irregular na camada externa, correspondente à exoderme.
Em raízes peludas transformadas obtidas por A.rizogenes, e cultivadas em hidroponia, o marcador GUS está especificamente localizado dentro da endoderme no surgimento de raízes laterais nas áreas feridas e nas exodermeis. Além de ser um método rápido, as raízes transgênicas obtidas com rizogenes agrobacterium também carregavam o DNA do plasmídeo indutor de raízes, que pode desregulamentar alguns processos diretamente controlados. As raízes peludas transgênicas obtidas com rizogenes agrobacterium podem ser mantidas durante a filmagem, mas alternativamente podem estar no local até propagar in vitro para produção massiva de trânsito.
A transformação da batata fornece uma boa ferramenta para verificar a função genética e a ativação do promotor, e também para produzir regras metodológicas em uma espécie de alto interesse agronômico. O organismo geneticamente modificado deve ser descartado com segurança após o uso para evitar contaminação ambiental. Além disso, a solução de gás contém derivados tóxicos de cianeto, por isso use proteção e descarte a solução com segurança.
