A cultura 3D torna mais difícil medir a função celular, usando ensaios biológicos padrão. Este protocolo permite a medição da atividade celular e somática sem maior processamento de amostras, utilizando um sensor fluorescente e um leitor de microplacão padrão. Este protocolo permite uma série de novas aplicações, incluindo a triagem de medicamentos de alto rendimento.
Além disso, o sensor fluorescente pode ser trocado com um sensor diferente para medir outras proteases ou funções celulares. É importante planejar cuidadosamente o experimento com antecedência, completar todos os cálculos para a preparação do hidrogel e configurar todos os equipamentos e reagentes para minimizar o tempo que as células estão em suspensão. Para começar, prepare a mídia de ensaio com 1%de carvão descascado soro bovino fetal, dois mM L-glutamina, 10 unidades por mL de penicilina e 10 microgramas por mL de estreptomicina.
Não use mídia vermelha fenol, que tem mais interferência de fluorescência. Para fazer controles positivos, adicione a enzima de colagem bacteriana tipo um à mídia de ensaio nas concentrações de 10 e 1000 microgramas por mL. Em seguida, prepare a solução precursora do hidrogel adicionando os reagentes a um tubo de 1,5 mL.
Certifique-se de vórtice após a adição de cada componente. Em seguida, divida a solução em vários tubos de 1,5 mL para diferentes condições. Para encapsular células em hidrogéis, primeiro prepare uma única suspensão celular lavando um prato de 10 cm de células de melanoma A375 com 10 mL de PBS.
Em seguida, adicione 0,05% de trippsina ao prato, para experimentar células. Incubar o prato a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, por três minutos. Após a incubação, conte as células com um hemótmetro.
Em seguida, centrifugar a solução celular a 314 vezes G por três minutos. Aspire a mídia cultural e resuspend células em buffer PBS em aproximadamente três vezes a densidade encapsulada final. Conte as células novamente para garantir uma concentração celular precisa.
Em seguida, adicione células suspensas em PBS a cada tubo da solução precursora do hidrogel de acordo com a densidade de semeadura necessária, e misture por tubulação para cima e para baixo. Para condições controladas, adicione apenas PBS e vórtice. Em seguida, pipeta 10 microliters da solução precursora de hidrogel no meio de cada poço de uma placa de poço estéril, preta e de fundo redondo 96.
Inspecione visualmente a colocação dos hidrogéis dentro dos poços. Hidrogéis não centrados podem ser reposicionados usando uma ponta de pipeta antes da polimerização. Para polimerizar a solução precursora do hidrogel, exponha a placa à luz UV a 4 milímetros por centímetro quadrado, por três minutos.
Em seguida, adicione 150 microliters da mídia de ensaio a todos os poços contendo células encapsuladas, e 150 microliters da solução de enzima colagenase aos poços de controles positivos. Adicione 150 microliters de tampão PBS aos poços externos da placa para reduzir a evaporação durante a incubação. Use um leitor de microplacão para medir a intensidade fluorescente da placa a zero hora, imediatamente após o encapsulamento.
Selecione o protocolo opaco de placa de 96 poços com excitação de 494 nanômetros e 521 comprimentos de onda de emissão de nanômetros. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono, por 18 horas. Em seguida, adicione reagentes de atividade metabólica a uma relação de 1 a 10 volumes por poço para todas as condições e controles.
Incubar a placa em 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, por seis horas. Por fim, meça a intensidade fluorescente da placa em 24 horas, pós encapsulamento. Selecione o protocolo opaco de placa de 96 poços, com excitação de 494 nanômetros, e 521 comprimentos de onda de emissão de nanômetros, para atividade MMP.
Para medir a atividade metabólica, selecione 560 nanômetros de excitação e 590 comprimentos de onda de emissão de nanômetros. Neste estudo, após a exposição do sensor fluorogênico à protease apropriada, o saciador e fluorohore são separados, e a fluorescência aumenta. As medidas de fluorescência dos hidrogéis incubados com enzima de colagem bacteriana tipo um, mostram que o menor sinal detectado foi produzido por controles negativos, sem colagemnase.
Enquanto o sinal mais alto detectado foi produzido por 1000 microgramas por mL de colagenase ou superior, quando o sinal começa a planar. A faixa de trabalho calculada foi de aproximadamente 0,16 a 474 microgramas por mL de colagenase. As leituras de fluorescência para a linha celular de melanoma A375, encapsuladas em uma série de densidades logo após o encapsulamento, foram baixas em densidades de semeadura, e semelhantes aos géis de controle sem células como esperado.
24 horas após o encapsulamento, a atividade de MMP foi diretamente proporcional à densidade de semeadura, e as densidades de semeadura em ou superiores a 1 milhão de células por mL, estão dentro dos limites da faixa de trabalho. As medidas de atividade metabólica da linha celular A375 também foram diretamente proporcionais à densidade de semeadura celular. Ao normalizar a atividade de MMP para a atividade metabólica, não houve diferença significativa na atividade de MMP por célula em densidades de semeadura superiores a 2 milhões de células por mL.
Técnicas adequadas de pipetação são importantes. Isso inclui dicas de pré-molhar para obter volumes precisos de soluções viscosas. Além disso, centralizar a solução precursora do hidrogel dentro do poço, é fundamental para obter medições precisas pelo leitor de placas.
Para identificar MMPs específicos que contribuem para a atividade de MMP medido aqui, ensaios de expressão como mancha ocidental ou PCR poderiam ser usados. O uso de células vivas requer procedimento de biossegurança adequado, técnica asséptica e um armário de segurança biológica. A luz UV é perigosa, use um escudo para proteger o usuário e não olhe diretamente para a luz.
