3D培養は、標準的な生物学的アッセイを使用して、細胞機能を測定することがより困難になります。このプロトコルは、蛍光センサと標準的なマイクロプレートリーダーを使用して、さらなるサンプル処理なしで細胞および体細胞活動の測定を可能にする。このプロトコルは、高スループットの薬物スクリーニングを含む多くの新しいアプリケーションを可能にします。
さらに、蛍光センサは、他のプロテアーゼまたは細胞機能を測定するために、別のセンサーと交換することができます。事前に実験を慎重に計画し、ヒドロゲル調製のためのすべての計算を完了し、細胞が懸濁する時間を最小限に抑えるためにすべての機器と試薬を設定することが重要です。まず、牛胎児血清を1%木炭除去し、2つのmM L-グルタミン、ペニシリン1mLあたり10単位、ストレプトマイシン1mLあたり10マイクログラムを取り除き、アッセイ培地を調製します。
蛍光干渉性が高いフェノールレッドメディアは使用しないでください。陽性のコントロールを行うために、細菌コラゲレーター酵素タイプ1をmLあたり10マイクログラムと1000マイクログラムの濃度でアッセイ培地に加えます。次に、1.5 mLチューブに試薬を加えてヒドロゲル前駆体溶液を調製する。
各成分を追加した後に必ず渦を出してください。その後、異なる条件のために複数の1.5 mLチューブに溶液を分割します。ヒドロゲル中の細胞をカプセル化するために、まず10mLのPBSでA375黒色腫細胞の10cm皿を洗浄して単一細胞懸濁液を調製する。
その後、0.05%トリプシンを皿に加え、細胞をトリプシン化する。37°Cと5%の二酸化炭素で3分間、皿をインキュベートします。インキュベーション後、ヘモサイトメーターで細胞を数える。
次に、細胞溶液を314倍Gで3分間遠心する。培養培地を吸引し、最終的に封入された密度の約3倍でPBSバッファー中の細胞を再懸濁させた。細胞をもう一度数え、細胞濃度を正確に保つ。
次いで、必要な播種密度に従ってヒドロゲル前駆体溶液の各チューブにPBS中の懸濁細胞を加え、上下にピペット処理して混合する。制御条件の場合は、PBSと渦のみを追加します。次に、ヒドロゲル前駆体溶液のピペット10マイクロリットルを、滅菌、黒色、丸底96ウェルプレートの各ウェルの中央に入れた。
ウェル内のヒドロゲルの配置を視覚的に検査します。非中心ヒドロゲルは、重合前にピペットチップを使用して再配置することができます。ヒドロゲル前駆体溶液を重合するために、プレートを1平方センチメートル当たり4ミリワットでUV光に3分間照射する。
次に、カプセル化された細胞を含むすべてのウェルにアッセイ培地150マイクロリットルを加え、150マイクロリットルのコラゲターゼ酵素溶液を陽性制御のウェルに加える。プレートの外側ウェルに150マイクロリットルのPBSバッファーを加え、インキュベーション中の蒸発を減らします。マイクロプレートリーダーを使用して、プレートの蛍光強度をゼロ時間で測定し、封入直後にポストします。
494ナノメートル励起、および521ナノメートルの発光波長を有する不透明な96ウェルプレートプロトコルを選択します。次に、プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素で18時間インキュベートします。その後、すべての条件とコントロールについて、ウェル当たり1〜10体積比で代謝活性試薬を追加します。
プレートを摂氏37度、5%の二酸化炭素で6時間インキュベートします。最後に、プレートの蛍光強度を24時間で測定し、封入後に行う。MMP活性のために不透明な96ウェルプレートプロトコル、494ナノメートル励起、および521ナノメートルの発光波長を選択します。
代謝活性を測定するには、560ナノメートル励起、および590ナノメートルの発光波長を選択します。本研究では、適切なプロテアーゼに蛍光センサを曝露すると、クエンチャーとフルオロフォアが分離され、蛍光が増加する。細菌性コラゲラーゼ酵素タイプ1を用いたインキュベートヒドロゲルの蛍光測定は、最も低い検出シグナルが、コラゲラーゼを伴う陰性対照によって生成されたことを示す。
検出された信号はコラゲターゼのmL当たり1000マイクログラム以上で生成されたが、信号が高原に始まると。計算された働き範囲はコラゲナーゼのmL当たり約0.16から474マイクログラムであった。A375メラノーマ細胞株の蛍光測定値は、カプセル化直後の密度の範囲にカプセル化され、播種密度全体にわたって低く、期待通りに細胞のない対照ゲルと同様であった。
カプセル化の24時間後、MMP活性は、播種密度に直接比例し、かつ1mL当たり100万個以上の細胞での播種密度は、働く範囲の限界内に収まる。A375細胞株の代謝活性測定は、細胞の播種密度にも直接比例した。MMP活性を代謝活性に正常化することにより、1mL当たり200万個を超える播種密度における細胞当たりのMMP活性に有意な差はなかった。
適切なピペット技術が重要です。これには、粘性ソリューションの正確なボリュームを達成するための事前湿潤のヒントが含まれます。また、ウェル内のヒドロゲル前駆体溶液の中心化は、プレートリーダーによる正確な測定を達成するために重要です。
ここで測定したMMP活性に寄与する特定のMMPを同定するために、ウェスタンブロットやPCRなどの発現アッセイを使用することができます。生細胞の使用は、適切なバイオセーフティ手順、無菌技術、および生物学的安全キャビネットを必要とします。紫外線は危険であり、シールドを使用してユーザーを保護し、光を直接見ないようにします。
