La culture 3D rend plus difficile la mesure de la fonction cellulaire, à l’aide d’analyses biologiques standard. Ce protocole permet de mesurer l’activité cellulaire et somatique sans autre traitement de l’échantillon, à l’aide d’un capteur fluorescent et d’un lecteur de microplaque standard. Ce protocole permet un certain nombre de nouvelles applications, y compris le dépistage de médicaments à haut débit.
En outre, le capteur fluorescent peut être échangé avec un capteur différent pour mesurer d’autres protéases ou fonctions cellulaires. Il est important de planifier soigneusement l’expérience à l’avance, de compléter tous les calculs pour la préparation de l’hydrogel et de configurer tous les équipements et les réaccents afin de minimiser le temps de suspension des cellules. Pour commencer, préparez les supports d’analyse avec 1% de sérum bovin fœtal dépouillé de charbon de bois, deux mM L-glutamine, 10 unités par mL de pénicilline, et 10 microgrammes par mL de streptomicine.
N’utilisez pas de supports rouges phénol, qui a plus d’interférence de fluorescence. Pour faire des contrôles positifs, ajouter l’enzyme bactérienne collagène type un au média d’analyse aux concentrations de 10 et 1000 microgrammes par mL. Ensuite, préparez la solution précurseur de l’hydrogel en ajoutant les reagents à un tube de 1,5 mL.
Assurez-vous de vortex après l’ajout de chaque composant. Divisez ensuite la solution en plusieurs tubes de 1,5 mL pour différentes conditions. Pour encapsuler les cellules dans les hydrogels, préparez d’abord une suspension à cellule unique en lavant un plat de 10 cm de cellules mélanome A375 avec 10 mL de PBS.
Ensuite, ajouter 0,05% trypsine au plat, pour trypsiniser les cellules. Incuber le plat à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, pendant trois minutes. Après l’incubation, compter les cellules à l’amiomètre.
Ensuite, centrifuger la solution cellulaire à 314 fois G pendant trois minutes. Aspirez le média de culture, et résuspendez les cellules dans le tampon PBS à environ trois fois la densité finale encapsulée. Comptez à nouveau les cellules pour assurer une concentration cellulaire précise.
Ensuite, ajoutez des cellules suspendues dans PBS à chaque tube de la solution précurseur de l’hydrogel en fonction de la densité d’ensemencement requise, et mélangez en pipetting de haut en bas. Pour les conditions contrôlées, il suffit d’ajouter PBS et vortex. Ensuite, pipette 10 microlitres de la solution précurseur hydrogel dans le milieu de chaque puits d’une stérile, noir, à fond rond 96 plaque de puits.
Inspecter visuellement le placement des hydrogels à l’intérieur des puits. Les hydrogels non centrés peuvent être repositionnés à l’aide d’une pointe de pipette avant la polymérisation. Pour polymériser la solution précurseur de l’hydrogel, exposez la plaque à la lumière UV à 4 milliwatts par centimètre carré, pendant trois minutes.
Ensuite, ajoutez 150 microlitres des supports d’analyse à tous les puits contenant des cellules encapsulées, et 150 microlitres de la solution enzymatique de collagène aux puits des contrôles positifs. Ajouter 150 microlitres de tampon PBS aux puits extérieurs de la plaque pour réduire l’évaporation pendant l’incubation. Utilisez un lecteur de microplaque pour mesurer l’intensité fluorescente de la plaque à zéro heure, immédiatement après l’encapsulation.
Sélectionnez le protocole opaque des plaques de puits 96 avec excitation de 494 nanomètres et longueurs d’onde d’émission de 521 nanomètres. Ensuite, incuber la plaque à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5%, pendant 18 heures. Ajoutez ensuite des réaccents d’activité métabolique à un rapport volume/volume d’un à dix par puits pour toutes les conditions et contrôles.
Incuber la plaque à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone, pendant six heures. Enfin, mesurez l’intensité fluorescente de la plaque à 24 heures, après encapsulation. Sélectionnez le protocole opaque de plaque de puits 96, avec excitation de 494 nanomètres, et longueurs d’onde d’émission de 521 nanomètres, pour l’activité de MMP.
Pour mesurer l’activité métabolique, sélectionnez 560 nanomètres d’excitation et des longueurs d’onde d’émission de 590 nanomètres. Dans cette étude, lors de l’exposition du capteur fluorogène à la protéase appropriée, le quencher et le fluorophore sont séparés, et la fluorescence augmente. Les mesures de fluorescence des hydrogels incubés avec l’enzyme bactérienne de collagène type un, montrent que le signal détecté le plus bas a été produit par des contrôles négatifs, sans collagène.
Alors que le signal détecté le plus élevé a été produit par 1000 microgrammes par mL de collagène ou au-dessus, lorsque le signal commence à plafonner. La plage de travail calculée était d’environ 0,16 à 474 microgrammes par mL de collagène. Les lectures de fluorescence pour la lignée cellulaire du mélanome A375, encapsulées dans une gamme de densités juste après l’encapsulation, étaient faibles à travers les densités d’ensemencement, et semblables aux gels de contrôle sans cellules comme prévu.
24 heures après l’encapsulation, l’activité mmp était directement proportionnelle à la densité d’ensemencement, et les densités d’ensemencement à ou plus d’un million de cellules par mL, entrent dans les limites de la plage de travail. Les mesures d’activité métabolique de la lignée cellulaire A375 étaient également directement proportionnelles à la densité d’ensemencement cellulaire. En normalisant l’activité de MMP à l’activité métabolique, il n’y avait aucune différence significative dans l’activité de MMP par cellule aux densités d’ensemencement plus grandes que 2 millions de cellules par mL.
Des techniques appropriées de pipetage sont importantes. Cela inclut des conseils de pré-mouillage pour atteindre des volumes précis de solutions visqueuses. En outre, le centre de la solution précurseur hydrogel dans le puits, est essentiel pour atteindre des mesures précises par le lecteur de plaque.
Pour identifier les MMP spécifiques qui contribuent à l’activité mmp mesurée ici, des analyses d’expression telles que la tache occidentale ou pcr pourraient être utilisées. L’utilisation de cellules vivantes nécessite une procédure de biosécurité appropriée, une technique aseptique et une armoire de sécurité biologique. La lumière UV est dangereuse, utilisez un bouclier pour protéger l’utilisateur et ne regardez pas directement dans la lumière.
