3D 배양은 표준 생물학적 측정을 사용하여 세포 기능을 측정하는 것을 더 어렵게 만듭니다. 이 프로토콜은 형광 센서와 표준 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 추가 샘플 처리 없이 세포 및 체세포 활성을 측정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 높은 처리량 약물 검사를 포함하여 새로운 응용 프로그램의 수를 가능하게합니다.
또한 형광 센서는 다른 센서와 교환하여 다른 프로테아제 또는 세포 기능을 측정할 수 있습니다. 실험을 미리 신중하게 계획하고, 하이드로겔 준비를 위한 모든 계산을 완료하고, 모든 장비와 시약을 설치하여 세포가 현탁액에 있는 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 시작하려면, 1%의 숯이 제거된 태아 소 세럼, 2m L-글루타민, 페니실린 mL 당 10단위, 연쇄상 구균의 mL 당 10 마이크로그램으로 분석 매체를 준비하십시오.
형광 간섭이 더 많은 페놀 레드 미디어를 사용하지 마십시오. 긍정적인 대조군을 만들려면, 세균성 콜라게나아제 효소 타입 1을 분석 매체에 10 및 1000 마이크로그램의 농도로 추가하십시오. 다음으로, 시약을 1.5mL 튜브에 추가하여 하이드로겔 전구체 용액을 준비한다.
각 구성 요소를 추가한 후 소용돌이를 피하십시오. 그런 다음 용액을 여러 가지 조건에 대해 여러 1.5 mL 튜브로 나눕니다. 하이드로겔에 세포를 캡슐화하기 위해 먼저 PBS 10mL로 A375 흑색종 세포의 10cm 접시를 세척하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
그런 다음, 접시에 0.05 %의 트립신을 추가하여 세포를 시험합니다. 3분간 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 접시를 배양합니다. 잠복 후 혈종계로 세포를 계산합니다.
다음으로, 세포 용액을 3분 동안 314회 G로 원심분리합니다. 배양 배지를 흡인하고, PBS 버퍼에서 세포를 최종 캡슐화된 밀도의 약 3배로 재보선한다. 정확한 세포 농도를 보장하기 위해 세포를 다시 계산합니다.
이어서, 필요한 시딩 밀도에 따라 하이드로겔 전구체 용액의 각 튜브에 PBS에 부유 된 세포를 추가하고, 위아래로 파이펫팅하여 혼합한다. 제어된 조건의 경우 PBS와 소용돌이만 추가합니다. 다음으로, 하이드로겔 전구체 용액의 파이펫 10 마이크로리터는 멸균, 블랙, 둥근 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰의 중간에 들어갑니다.
우물 내의 하이드로겔 배치를 시각적으로 검사합니다. 비중심 하이드로겔은 중합화 전에 파이펫 팁을 사용하여 재배치할 수 있다. 하이드로겔 전구체 용액을 중합하려면 플레이트를 평방 센티미터당 4밀리와트에서 3분 동안 UV 광에 노출시하십시오.
다음으로, 캡슐화된 세포를 포함하는 모든 웰에 분석 매체의 150마이크로리터와 콜라게나아제 효소 용액 150마이크로리터를 양성 대조군의 유분에 추가한다. 150 마이크로리터의 PBS 버퍼를 플레이트의 외부 우물에 추가하여 인큐베이션 중 증발을 줄입니다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트의 형광 강도를 0시간 에서 측정하고 즉시 캡슐화를 게시합니다.
494 나노미터 여기, 521 나노미터 방출 파장을 가진 불투명 96 웰 플레이트 프로토콜을 선택합니다. 다음으로, 18시간 동안 이산화탄소 5%에서 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 모든 조건 및 컨트롤에 대해 잘 당 1- 10 부피 비율로 대사 활성 시약을 추가합니다.
플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 6시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 플레이트의 형광 강도를 24시간, 캡슐화 후지에서 측정합니다. MMP 활성을 위해 불투명 96 웰 플레이트 프로토콜을 선택하여 494나노미터 외발, 521나노미터 방출 파장을 선택한다.
대사 활성을 측정하려면 560 나노미터 외야 및 590 나노미터 방출 파장을 선택합니다. 이 연구에서는, 적절한 프로테아제에 형광 센서가 노출되면, 담종과 형광이 분리되고 형광이 증가합니다. 세균 콜라게나아제 효소 타입 1을 가진 배양된 하이드로겔의 형광 측정은, 가장 낮은 검출된 신호가 콜라게나아제 없이 음성 대조군에 의해 생성된다는 것을 보여줍니다.
가장 높은 검출 된 신호는 콜라게나아제 이상의 mL 당 1000 마이크로 그램에 의해 생성되었지만 신호가 고원되기 시작할 때. 계산된 근로 범위는 콜라게나아제의 mL 당 약 0.16에서 474 마이크로그램이었다. 캡슐화 직후 밀도 범위에서 캡슐화된 A375 흑색종 세포주형에 대한 형광 수치는 종자 밀도에 걸쳐 낮았으며, 예상대로 세포가 없는 젤을 제어하는 것과 유사했다.
캡슐화 후 24시간, MMP 활성은 종자 밀도에 직접 비례했으며, mL당 100만 개 이상의 세포에서 파종 밀도는 근로 범위의 한계에 속한다. A375 세포주들의 대사 활성 측정은 세포 파종 밀도에 직접 비례하였다. MMP 활성을 대사 활성으로 정상화시킴으로써, mL당 200만 개 이상의 세포보다 큰 종자 밀도에서 세포당 MMP 활성에 유의한 차이가 없었다.
적절한 파이펫팅 기술이 중요합니다. 여기에는 점성 솔루션의 정확한 볼륨을 달성하기 위한 사전 습윤 팁이 포함됩니다. 또한, 하이드로겔 전구체 용액을 웰 내에서 중심으로 플레이트 판독기의 정확한 측정을 달성하는 것이 중요합니다.
여기에서 측정된 MMP 활동에 기여하는 특정 MmP를 식별하기 위해 서부 블롯 또는 PCR과 같은 식 소방법을 사용할 수 있습니다. 살아있는 세포의 사용은 적절한 생체 안전 절차, 무균 기술 및 생물학적 안전 캐비닛이 필요합니다. 자외선은 위험하며, 보호막을 사용하여 사용자를 보호하며, 빛을 직접 바라지 않습니다.
