Os procedimentos de teste de toxicidade serão demonstrados pelo Dr. Ashok Aspatwar, um pesquisador sênior do meu laboratório. Nosso protocolo identifica efeitos fora do alvo e detecta efeitos tóxicos sutis de produtos químicos na fase inicial da descoberta que podem ser perdidos na cultura celular ou outros modelos animais. As principais vantagens de nossa técnica são: é rápida e eficiente, requer uma quantidade muito pequena de produtos químicos, e as instalações básicas do laboratório.
O rastreamento de toxicidade nos ajudará a decidir a concentração para estudar sua eficiência contra a micobacterium que causa a tuberculose e para um cálculo pré-clínico. Este método utiliza insights sobre efeitos fora do alvo de produtos químicos e, portanto, este método pode ser usado em qualquer área de pesquisa onde a toxicidade da química é de importância primária. Este método é muito simples e pode ser realizado por qualquer pessoa sem experiência prévia.
Indivíduos sem experiência devem planejar o experimento cuidadosamente e usar apenas um composto. Este método fornece efeitos tóxicos dos produtos químicos na forma de alterações fenotípicas nos embriões de zebrafish em desenvolvimento e, portanto, a segurança dos compostos testados. Para começar, coloque de dois a cinco zebrafish machos adultos e três a cinco zebrafish fêmeas adultas em tanques de acasalamento durante a noite.
Pela manhã, acenda a luz à medida que a reprodução é induzida pelo ciclo automático de luz escura e subsequente. Para evitar o tratamento do estresse aos animais, permita que os animais descansem por duas semanas antes de usar os mesmos indivíduos para reprodução. No dia seguinte antes do meio-dia, colete os embriões usando um coador de malha fino, e transfira-os para uma placa de petri contendo meio de embrião E3.
Coloque a placa de petri sob um microscópio estéreo para examinar cada lote de embriões. Identifique a aparência opaca e remova-as como embriões não fertilizados ou mortos. Mantenha os embriões a 28,5 graus Celsius em uma incubadora durante a noite.
Na manhã seguinte, examine os embriões sob um microscópio estéreo e remova quaisquer embriões insalubres ou mortos. Use cuidadosamente uma pipeta pasteur para transferir um embrião para cada poço de uma placa de 24 poços. Certifique-se de que cada poço contém meio E3 suficiente para cobrir os embriões.
Tire os frascos que contêm compostos inibidores armazenados a 4 graus Celsius em uma geladeira. Use um equilíbrio analítico para pesar a quantidade apropriada do composto e prepare 250 microliters de 100 mililitros de solução de estoque para cada composto em meio E3 ou outro solvente apropriado. Em seguida, use o meio E3 para fazer diluições seriais das soluções de estoque baseadas em níveis de toxicidade em tubos de centrífuga de 15 mililitros.
Dos poços que cada um contém um embrião DPF, use uma pipeta pasteur e uma pipeta de 1 mililitro para remover a água E3 uma linha de cada vez. Distribua imediatamente 1 mililitro de cada diluído das soluções de estoque nos poços da placa de 24 poços a partir do baixo e movendo-se para maior concentração. Para os grupos de controle, adicione água E3 ou outro solvente relevante.
Rotule 24 placas de poço com o nome e concentração do composto e mantenha as placas a 28,5 graus Celsius em uma incubadora. Tome cuidado para que os diluentes dos produtos químicos nos poços não seja evaporado na incubadora selando as laterais de 24 placas de poço. Vinte e quatro horas após a exposição dos compostos químicos, use uma pipeta pasteur para transferir as larvas expostas a cada concentração do composto em uma pequena placa de petri contendo celulose de metila de 3% de alto peso molecular.
Com uma sonda de metal, coloque-a de lado. Coloque a placa de petri sob um microscópio estéreo ligado a uma câmera. Tire as imagens e salve as imagens em uma pasta separada a cada dia até o final do experimento.
Digite todas as observações em uma tabela todos os dias, seja em uma mesa online ou em uma folha impressa. Para exposição a compostos neurotóxicos, as quatro a cinco larvas DPF podem mostrar padrão de natação anormal. Nesse caso, faça um registro de tais mudanças capturando um curto vídeo de 30 segundos a um minuto das larvas.
Após cinco dias de exposição aos compostos químicos, note a concentração em que metade dos embriões morrem como a concentração letal meio máxima 50 de cada produto químico. Construa uma curva para mortalidade de embriões para todas as concentrações utilizando um programa adequado. Neste protocolo, a parte crítica da avaliação da toxicidade é testar diferentes concentrações de um ou múltiplos compostos químicos em um único experimento.
Para os compostos que induzem quaisquer defeitos fenotípicos nas larvas, os defeitos foram registrados a cada 24 horas durante o período de um a cinco dias após a exposição ao produto químico. Os embriões tratados com inibidores beta CA nas concentrações de 250 micromolares e 125 micromolars apresentam vários defeitos fenotípicos em comparação com o controle. Por exemplo, embriões não-esques mesmo no dia 3, estrutura corporal curva, saco de gema não usado e edema pericárdico, e ausência de sacos de otolito nas larvas cinco dias após o tratamento.
Em outro estudo, os embriões tratados com inibidores de CA mostraram a ausência de sacos de otolito e bexiga de natação. Os experimentos identificaram um composto representativo de anidrato 9, que induziu alterações fenotípicas mínimas ou não durante o desenvolvimento embrionário a 500 micromolar. O composto mostrou alta concentração de LC50.
No entanto, em comparação com um controle, o mesmo composto em 300 micromolar foi encontrado como neurotóxico e induziu ataxia nas larvas após cinco dias de exposição. Boa qualidade dos embriões são importantes para a triagem de toxicidade de produtos químicos. Para obter embriões de boa qualidade, use um par jovem de zebrafish adulto para reprodução.
Os compostos que emergem como seguros podem ser ainda mais caracterizados pela realização de experimentos in vitro e in vivo relevantes. No campo do desenvolvimento de drogas antituberculose, essa técnica ajudou a criar mais experimentos para incobadão in vivo de mycobacterium marinum em embriões de zebrafish. O protocolo envolve o uso de produtos químicos que podem ser tóxicos para os humanos.
As pessoas envolvidas nos experimentos devem tomar os devidos cuidados ao manusear os produtos químicos.
