PAC é parcialmente financiado por uma subvenção para T32 NIH Universidade de Wisconsin Programa de Formação de Células-Tronco (PA Clark). JSK foi parcialmente financiado pela HEADRUSH Cátedra de Pesquisa do tumor cerebral, Loff Roger Memorial GBM Fundo de Investigação, e da Fundação UW / Neurocirurgia Pesquisa tumor no cérebro e Fundo de Educação. JCW e YH são parcialmente suportados pelo NIH concessão NIBIB 1R01EB009103-01.

1. BTSC célula de dissociação BTSCs são derivadas de pré-existentes culturas são crescidas em meio isento de soro de células estaminais como neuroesferas. cultura da qual é previamente descrito 10, 11. <ol><li> Preparar a suspensão de células a partir de derivados de BTSC neuroesferas. BTSC derivados neuroesferas são recolhidas num tubo de 15 ml e centrifugado a 900 rpm durante 5 minutos. Faster centrifugação lata de cisalhamento e / ou danificar as neuroesferas. O sobrenadante é aspirado e a cultura neuroesfera é ressuspenso em 0,5 ml de pré-aquecido Accutase. Esta solução é incubada durante 5-10 minutos a 37 ° C permitindo que os neuroesferas a afrouxar. As células são mecanicamente interrompidos com 10-20 movimentos suaves de uma pipeta P100 e depois 1,5 ml de meio de células estaminais é adicionado às células de neutralizar a Accutase. </li><li> Os BTSCs são então centrifugadas a 1300 rpm durante 5 minutos, e ressuspensas em 1 ml de meio de células estaminais. </li><li> Uma alíquota de 50 ul foi removida dos suspension e colocado dentro de um tubo de microcentrífuga para contagem das células. 50 ul de azul de tripano é adicionado ao tubo de Eppendorf e a suspensão é colocada num hemocitómetro para contagem das células. </li><li> Se necessário, após a contagem das células, o meio de células estaminais adicionais é adicionada à suspensão BTSC para dar uma densidade celular de 20000 células vivas / media ul. </li></ol> 2. Fabricação de bi-camadas su-8 mestre e moldagem de selo PDMS (ver figura 1) Usamos litografia óptica e de litografia suave para fabricar su-8 mestre e PDMS selo, que são essenciais para a montagem dos dispositivos microfluidicos. Ligeiramente diferente do que o processo normal de 12, a su-8 mestre é composto de duas camadas. Os microcanais 3 mícrons de altura são fundidos em que a primeira camada / inferior mais cedo no processo, enquanto as câmaras de 250 mícrons de altura de semeadura e recepção estão na segunda camada / superior. Para que a conexão correta entre dois compartimentos de cultura (microcanaiss e câmaras), as duas camadas têm de ser alinhados com precisão na sua posição. No entanto, a espessura e opacidade da segunda camada são suficientemente grandes para bloquear o alinhador fiducial / óptica de aceder aos recursos de fundo. Aqui nós desenhar as máscaras com marcadores fiduciais sendo posicionado remotamente. Assim, esses marcadores na primeira camada pode ser selectivamente protegidos durante a rotação da segunda camada. Como resultado, ambas as camadas de recursos são feitas em um mestre e pronto para a moldagem em baixo-relevo do carimbo PDMS. <ol><li> Projetar e preparar dois foto-máscaras. Uma máscara é constituída por dois marcadores fiduciais e uma matriz de microcanais (400 m de comprimento e 10-50 uM de largura) para a primeira camada. Outra máscara consiste em semear e receber as câmaras (2 mm de comprimento e 600 um de largura), para a segunda camada. Ambas as máscaras são concebidos em Illustrator (Adobe, Califórnia), laser-impresso em filmes transparentes (peças de metal finas, Colorado), lavadas com isopropanol e seco ao ar. </li><li> Fazer com que a primeira camadasu-8 fotorresiste (Microchem, Massachusetts), de acordo com o manual do produto do fornecedor. Primeiro, spin-revestimento da pastilha pega (Materiais WRS, Califórnia) com 3-um de espessura fotorresistência de su-8 (5), seguido por mole de cozimento. O fotorresiste é então ultravioleta-exposta e curada com a máscara correspondente em contacto de perto, seguido de pós-cozimento e em desenvolvimento. </li><li> Spin-revestimento da segunda camada de 250 um de espessura, com su-8 (2100). A fim de evitar fotorresiste espesso de bloquear os marcadores fiduciais da primeira camada, que cobrem estas áreas com fita adesiva em rotação antes do revestimento da segunda camada. A fita é então arrancada para revelar os marcadores para fins de alinhamento. </li><li> UV-expor a segunda camada com a segunda máscara. Com os marcadores de alinhamento revelado, é muito simples para alinhá-los para os da segunda máscara usando alinhador de máscara óptica. A segunda camada de material fotosensitivo é então exposta e ultravioleta curado em contacto próximo, seguida de pós-cozedura e em desenvolvimento. &lt;/ Li&gt; <li> Anti-stick revestimento do mestre resultou. Para ajudar na remoção de PDMS curado, o su-8 mestra pode ser silanizada via deposição de vapor para fazer a superfície de um revestimento antiaderente tipo. Basta colocá-lo num exsicador durante pelo menos uma hora, com várias gotas de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) solução de silano, sob vácuo. </li><li> Moldar PDMS com o mestre. Misturar base de pré-polímero de PDMS e curador de Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) em 10:1 completamente. Colocá-lo num exsicador para desgaseificação a vácuo até nenhuma bolha de ar é vista. Despeje a mistura sobre a máscara e desgaseificar novamente se bolha de ar novo é introduzido. Curar o molde numa placa de aquecimento para o nível de 2 horas a 90 C. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, gentilmente liberar o selo PDMS. Assim, a cultura de canais são gravados em PDMS e pronto para a montagem do dispositivo. O mestre é reutilizável para a moldagem até que esteja rachado ou desgastado. O revestimento anti-aderente tem de ser executado novamente quando a viscosidade retoma. </li></ol> 3.Conjunto de dispositivos microfluidicos e cultura de células (Figura 2) A fim de células de cultura, característica-gravado selo PDMS está ligado a uma lamela de vidro para formar canais fechados. Entradas e saídas são criados para carregar a cultura / media. Por outro lado, a limpeza e outros procedimentos para o substrato de vidro e carimbo PDMS são necessários para assegurar a compatibilidade celular. <ol><li> Fazer reservatórios através do selo PDMS usando biópsia furador. Nós escolher o seu diâmetro ser de 6 mm. Estes reservatórios servem para duas finalidades. Um é para conter nutrientes extra para o crescimento celular. A outra é para o acesso de pipetas de carregamento e de aspiração a vácuo. </li><li> Embeber o selo PDMS em 70% de etanol durante 30 minutos e, em seguida, lavado com água desionizada para mais 10 min. O objectivo é eliminar potenciais resíduos orgânicos introduzidos durante o processo de fabrico, e não reticulado contaminação PDMS. Mais intensas e completa processos de limpeza, tais como extração orgânica 13 </sup&gt; E Soxhlet de extracção 14 foram usados ​​em outra parte. No entanto, achamos desnecessário na cultura BTSC. </li><li> Esteriliza-se o carimbo de PDMS usando autoclave (121 ° C, 35 min). Este passo completa a reacção de reticulação de PDMS. A partir deste passo, e até que o passo 3.6, todos os procedimentos são tomadas de uma forma estéril. </li><li> O carimbo de PDMS é então colocada sobre uma lamela de vidro, que é previamente revestidas com poli-L-lisina. 15-17 O dispositivo é então revestida com laminina, enchendo o canal com laminina solução durante a noite a 37 ° C. A laminina é aspirado a partir do dispositivo e o dispositivo é lavado com o meio de células estaminais. </li><li> Carregar suspensão de células a partir do passo 1 em reservatórios e canais. 11 ul de células dissociadas são colocados em um reservatório de semeadura. A aspiração a vácuo é utilizada para forçar as células dentro da câmara de propagação, se necessário. Um adicional de 7 uL de células são colocadas no reservatório de semeadura adjacente. Nota: densidade celular média é de 20.000 células / uL mídia. À réer cinco minutos, a semeadura e reservatórios que recebem são inundadas com a mídia. </li><li> Coloque um 0,5-1 mm pré-autoclavadas folha PDMS no topo. A adesão superficial ocorreu naturalmente entre dois pedaços de PDMS vai fazer a cultura de células selado e pronto para a incubação de transporte, e de imagem microscópica. </li></ol> 4. De longo prazo de imagem time-lapse de BTSC migração com BioStation IM (Nikon Instruments Inc, Melville, EUA). Combinando câmara, software e incubadora numa só embalagem, este sistema microscópico permite a cultura de células de imagem sem perturbação durante dias. Além disso, o seu design único motor move a lente objetiva e mantém fase estacionária na amostra o recurso de ponto-visita. Isto torna mais prática a experiências de imagem paralelas e locomoção celular em faixa de alto rendimento do ensaio. <ol><li> Pré-equilibrar a IM Biostation durante 45 minutos para estabilizar o fornecimento de humidade, temperatura e ar. Além de vários água cont-pratos ained na câmara de amostragem é utilizado para manter a humidade adequada. </li><li> Carregar o dispositivo célula-suficiente na câmara de amostra de microscópio, e centralizá-lo, usando uma pinça micro. </li><li> Ajuste o foco, a posição de pontos e tempo-pontos em software Biostation e iniciar o lapso de tempo. </li></ol> 5. Os resultados representativos: Exemplos de inspecção visual e caracterização de migração de células de cancro por meio de um dispositivo de microfluidos compartimentalizar estão ilustrados na Figura 3 e Figura 4. A linha celular é BTSC. Com a nossa configuração actual, as imagens da fase de cultura de células pode ser continuamente registadas durante o tempo de 5 dias (Figura 3) e tão frequente como a cada 2 segundos (Figura 4). Além de 5 dias, meios de cultura precisam ser substituídos para a reposição de nutrientes e resíduos removidos. Nosso longo prazo lapso de tempo identifica uma seqüência rotativa de seis estágios celulares durante sua migração com base nas alterações morfológicas. Como ilustrailustrado na Figura 3, descreve-los como (i) pré-migração, (ii) a iniciação, (iii) o caminho-exploração, (iv) de cruzeiro, (v) destino exloration-e (vi) após a migração. Na câmara receptora, células fusiformes permanecer na etapa (i) como em tumores de massa que são capazes de crescer, dividir e migrar gradualmente. Ao se aproximarem da entrada de microcanais, algumas células prosseguir para o estágio (ii) quando se expandir e gerar saliência adesiva. Apenas um deles é capaz de ocupar a entrada e proceder à etapa (iii), o qual pode explorar a direcção da migração. Uma vez que a célula determina a direcção da migração, procede-se a fase (iv), para cruzar com os microcanais em uma velocidade constante e elevada, o que é realizado através do microcanal inteiro. No final de microcanais, o produto de células de fase (v), para explorar o espaço aberto da câmara de recepção, e, em seguida, a etapa (vi). Em microcanais, poder migrar é maioritariamente gerada por blebbing actividade como ilustrado na figura 4, semelhante ao da amebóide cell. Blebbing celular e deformação membrana são totalmente gravado aqui. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esquema de fabricação de dispositivos microfluídicos. Todo o processo é realizado sobre uma bolacha de alça de 3 polegadas de silício por meio de uma técnica modificada de litografia suave. 3 mícrons de altura microcanais e marcadores de alinhamento são feitos como na primeira camada. Em seguida, com 250 um de espessura su-8 é spin-revestido, enquanto que as marcas de alinhamento são cobertos com fita adesiva, de modo que possam mais tarde ser acessível para mascarar alinhador sem visão de bloqueio por fotorresiste espesso. Assim, as características da câmara pode ser feita como a segunda camada e precisamente alinhada com a primeira camada. Selo PDMS é eventualmente moldada fora do mestre resultante. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esquema de montagem do dispositivo e processo de sementeira de células. Cercada por PDMS e gllamela bunda, o espaço de cultura 3D é composto de câmaras, reservatórios e microcanais. A câmara é enchida com a semeadura da cultura de células, enquanto que a câmara de recepção é inicialmente preenchido com células livres de meios de comunicação. Os microcanais que se conectam entre eles fornecer trilha de células migrando de um lado para receber a semeadura lado. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. BTSC migração através de microcanais. Superior: instantâneos de lapso de tempo mostrar uma única célula (destacado em verde) migra mais de 400 m do lado de semeadura para o lado de recepção. Toda a viagem leva cerca de 2 dias, envolvendo uma seqüência de alterações morfológicas celulares. A barra de escala é de 40 m. Abaixe: a representação dos desenhos animados de seis estágios de migração. Pré-migração (i): Na câmara de sementeira, as células fusiformes e divisível gradualmente migram ao longo uns dos outros. As células próximas raça entrada de microcanais uns com os outros, polarizando corpo celular e e<html> xerting protrusão lamellipodia. Iniciação (ii): A célula migratória com a maior capacidade ocupa na entrada do canal, enquanto seus concorrentes vai recuar. Path-exploração (iii): As alterações das células migratórias para um modo amebóide com polaridade pouco. Este modo de migração é extremamente móvel e capaz de explorar caminho em todas as direcções por vesículas de membrana protuberâncias pequenas. Cruzando (iv): Uma vez que o percurso de migração é determinada, a célula se transforma em um modo adaptado amebóide mantendo uma saliência adicional grande posição para a frente. Desta forma, mantém uma célula de motilidade elevada, bem como uma orientação constante e velocidade. Destino-exploração (v): Ao fim de percurso, a célula diminui e desenvolve filopodias para explorar a câmara receptora para qualquer alvo invasão. Pós-migração (vi): Depois de entrar na câmara de recepção, a célula torna-se em forma de estrela e retém a motilidade elevada mas sem direcção determinada. &quot;/&gt; . Figura 4 Instantâneos de lapso de tempo mostrar o ciclo de vesículas e membranas atividade deformação de um BTSC: (AB). iniciação; (BD). Expansão, (DF). Retração. As setas e curva-linhas representam a direção e localização da deformação da membrana, respectivamente. Os instantâneos são coletadas a cada 8 segundos.

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	<li>Carke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Stem+Cells-Perspectives+on+Current+Status+and+Future+Directions.">Cancer Stem Cells-Perspectives on Current Status and Future Directions.</a> AACR Workshop on Cancer Stem Cells. Cancer Research. 66, 9339-9344 (2006).</li><li>Stupp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352, 987-996 (2005).</li><li>Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cancer+cell+invasion.">Mechanisms of cancer cell invasion.</a> Current Opinion in Genetics &#38; Development. 15, 87-96 (2005).</li><li>Shackleton, M., Quintana, E., Fearon, E. R., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+Cancer:+Cancer+Stem+Cells+versus+Clonal+Evolution.">Heterogeneity in Cancer: Cancer Stem Cells versus Clonal Evolution.</a> Cell. 138, 822-829 (2009).</li><li>Karnoub, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+within+tumour+stroma+promote+breast+cancer+metastasis.">Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis.</a> Nature. 449, 557-557 (2007).</li><li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+Devices:+New+Tools+for+Studying+Cancer+and+Cancer+Stem+Cell+Migration.">Microfluidics-based Devices: New Tools for Studying Cancer and Cancer Stem Cell Migration.</a> Biomicrofluidics. 5, (2011).</li><li>Rolli, C. G., Seufferlein, T., Kemkemer, R., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Tumor+Cell+Cytoskeleton+Organization+on+Invasiveness+and+Migration:+A+Microchannel-Based+Approach.">Impact of Tumor Cell Cytoskeleton Organization on Invasiveness and Migration: A Microchannel-Based Approach.</a> Plos One. 5, (2010).</li><li>Chung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+into+scaffolds+under+co-culture+conditions+in+a+microfluidic+platform.">Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform.</a> Lab on a Chip. 9, 269-275 (2009).</li><li>Irimia, D., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+migration+of+cancer+cells+under+conditions+of+mechanical+confinement.">Spontaneous migration of cancer cells under conditions of mechanical confinement.</a> Integrative Biology. 1, 506-512 (2009).</li><li>Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells.">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85, 141-152 (1998).</li><li>Clark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+cancer+stem+cells+exhibit+decreased+dependence+on+exogenous+growth+factors+for+proliferation+and+survival.">Glioblastoma cancer stem cells exhibit decreased dependence on exogenous growth factors for proliferation and survival.</a> , .</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 37, 551-575 (1998).</li><li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities.">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab on a Chip. 7, 987-994 (2007).</li><li>Regehr, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+implications+of+polydimethylsiloxane-based+microfluidic+cell+culture.">Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture.</a> Lab on a Chip. 9, 2132-2139 (2009).</li><li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation.">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nature Cell Biology. 9, 1347-1347 (2007).</li><li>Hu, X. D., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Dependent+Dynamic+Microtubule+Invasion+of+Dendritic+Spines.">Activity-Dependent Dynamic Microtubule Invasion of Dendritic Spines.</a> Journal of Neuroscience. 28, 13094-13105 (2008).</li><li>Vitzthum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+Na(+)/H(+)+exchange-mediated+pH(i)+regulations+in+neuronal+soma+and+neurites+in+compartmentalized+microfluidic+devices.">Study of Na(+)/H(+) exchange-mediated pH(i) regulations in neuronal soma and neurites in compartmentalized microfluidic devices.</a> Integrative Biology. 2, 58-64 (2010).</li><li>Clark, P. A., Treisman, D. M., Ebben, J., Kuo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+signaling+pathways+in+brain+tumor-derived+stem-like+cells.">Developmental signaling pathways in brain tumor-derived stem-like cells.</a> Developmental Dynamics. 236, 3297-3308 (2007).</li><li>Chen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Hierarchy+of+Self-Renewing+Tumor-Initiating+Cell+Types+in+Glioblastoma.">A Hierarchy of Self-Renewing Tumor-Initiating Cell Types in Glioblastoma.</a> Cancer Cell. 17, 362-375 (2010).</li><li>Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+Stem+Cell+Lines+Expanded+in+Adherent+Culture+Have+Tumor-Specific+Phenotypes+and+Are+Suitable+for+Chemical+and+Genetic+Screens.">Glioma Stem Cell Lines Expanded in Adherent Culture Have Tumor-Specific Phenotypes and Are Suitable for Chemical and Genetic Screens.</a> Cell Stem Cell. 4, 568-580 (2009).</li><li>Lobo, N. A., Shimono, Y., Qian, D., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+cancer+stem+cells.">The biology of cancer stem cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 675-699 (2007).</li><li>Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li><li>Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).</li><li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumorigenic,+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma.">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Research. 64, 7011-7021 (2004).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O dispositivo micro e gravação de imagem técnica apresentada aqui permite uma caracterização visual da morfologia celular durante a migração. Em comparação com os métodos convencionais existentes, a plataforma microfluídica apresenta vantagens de custo-eficácia, alto rendimento e flexibilidade de design. O sistema de visualização apresentado microscópico permite estudo e gravação de longo prazo a migração de células vivas. O recurso de lente motorizado faz com que seja possível controlar vários caminhos de migração de uma imagem de alta-resolução, sem perturbar a amostra. Durante a montagem do dispositivo, o carimbo de PDMS não é permanentemente ligada ao lamela de vidro para a conveniência do revestimento PDL (passo 3.4). É crítico para conseguir uma boa vedação para o sucesso deste protocolo. Contaminação introduzida a partir da fabricação do dispositivo, tais como bolhas de ar no selo ou poeiras / detritos sobre o substrato, podem pôr em risco a ligação e provocar fugas de fluido. Portanto, TREATIng do dispositivo de uma maneira livre de poeira é importante para impedir a falha do dispositivo. Antes da PDL-revestimento, as lamelas de vidro são o ácido nítrico e a solução tratada PDL é centrifugada para eliminar as poeiras / detritos. Encontramos fita adesiva, álcool lavar, e banho de água muito útil na remoção de pó / resíduos do selo PDMS, se um quarto limpo não é acessível. Após o selo PDMS fazer contato com a lamela de vidro, batendo a marca delicadamente com uma pinça facilita o selo. BTSCs podem ser enriquecidos a partir de amostras humanas sala de operação através de cultura em meio de esfera de células-tronco, similar à cultura de células estaminais neurais normais 10. BTSCs enriquecidos desta forma demonstrar estaminais célula-como propriedades, tais como a expressão de marcadores de células-tronco (CD133, nestina), a diferenciação de várias linhagens neurais (glial e neuronal), e iniciação do tumor em um modelo de ratinho imunodeficiente ortotópico com tão pouco como 100 células 18. Apesar de algum debate existe sobre purificaçãocação e manutenção de BTSCs 1, 19-21, esfera crescidos BTSCs melhor manter o fenótipo e genótipo do tumor parental 22-24. O espaço compartimentado imita o ambiente fisiológico para a migração celular. Em nosso dispositivo, BTSC exibem uma forte capacidade de migração através de um espaço de tamanho limitado, regulando morfologia celular. Nossa caracterização das alterações celulares morfológicas indica o modo de transformações em uma seqüência etapa seis que podem modelar uma nova descrição detalhada possível de invasão BTSC do cérebro adjacente. Na fase inicial, as células ganhar uma quantia significativa de polaridade e gerar saliências adesivas para ancorar-se de forma eficaz no interior do microcanal. Uma vez que a ocupação célula do microcanal é estabelecida, ele converte para um modo de cruzeiro e mantém este modo para toda a viagem através de um microcanal. Nesta fase, a motilidade BTSC manter elevado e consistente direcção mas conservar a energia. Emterestingly, parece que um microcanal é restrita a uma célula de cruzeiro de cada vez, de tal modo que, quando um produto de células únicas para esta fase, recuo células outro do microcanal. Este mecanismo garante provável eficácia de tumor espalhando e evita o consumo excessivo de nutrientes em microcanais. Depois de completar a migração através do microcanal, uma célula recupera a sua propensão para saliências multidirecionais e posterior exploração alvos de invasão ou caminhos de migração novas. O dispositivo microfluídico compartimentalizando oferece um romance in vitro significa a criação de um microambiente para estudar infiltração BTSC de parênquima cerebral. Este método pode ser facilmente adaptado para o estudo do cancro da célula tronco (CSC) e linhas de células migratórias derivadas de outros tipos de tumor. A cultura de células no dispositivo micro pode ser realizado em qualquer laboratório de biologia moderna que está equipado com uma incubadora e experiência de cultura de tecidos. Equipado com um su-8 master, PDMSfundição e montagem de dispositivos são viáveis ​​com alguma formação fundamental em litografia macia. Além disso, a plataforma pode também ser estendido para outras aplicações, integrando com outros módulos funcionais tais como misturador de gradiente, padronização de superfície, de controlo de fluido e microeléctrodo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Meio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM), glicose elevada </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Cérebro de células-tronco de tumores (BTSC) fontes de cultura </td></tr><tr><td> F12 Ham </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31765 </td><td> Cérebro de células-tronco de tumores (BTSC) fontes de cultura </td></tr><tr><td> B27 suplemento de vitamina A menos </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td> Cérebro de células-tronco de tumores (BTSC) fontes de cultura </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico (PSA) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15240 </td><td> Cérebro de células-tronco de tumores (BTSC) fontes de cultura </td></tr><tr><td> Factor de Crescimento Epidérmico (EGF), recombinante humano </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0313 &lt;/ Td&gt; <td> Cérebro de células-tronco de tumores (BTSC) fontes de cultura </td></tr><tr><td> Factor de Crescimento de Fibroblastos básico (bFGF), recombinante humano </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0021 </td><td> Cérebro de células-tronco de tumores (BTSC) fontes de cultura </td></tr><tr><td> Sal de sódio de heparina, a partir de mucosa intestinal porcina </td><td> Sigma </td><td> H1027-250KU </td><td> Cérebro de células-tronco de tumores (BTSC) fontes de cultura </td></tr><tr><td> Laminina (mouse natural) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td> Cérebro de células-tronco de tumores (BTSC) fontes de cultura </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td> Cérebro de células-tronco de tumores (BTSC) fontes de cultura </td></tr><tr><td> Stem meio celular </td><td></td><td></td><td><ul><li> 30% Hams F12 </li><li> 70% DMEM </li><li> 1% de antibiótico-antimicótico </li><li> 2% B27, sem vitamina A </li><li> EGF (20 ng / mL) e bFGF / heparina (20 ng/ Ml bFGF, 5 heparina mg / ml) Misture os ingredientes e filtro estéril antes do uso </li></ul></td></tr><tr><td> Factor de Crescimento de Fibroblastos básico (bFGF) / Heparina </td><td></td><td></td><td><ul><li> Concentração aliquota de 20 ug / ml </li><li> Para 25 ^ g: Adicionar 1,25 mL de heparina 5mg/mL e 25 ug bFGF. </li><li> Para 250 mg: Adicione 1 ml de heparina 5mg/mL a 250 mg bFGF. Transferência para 15 mL cónico e adicionar 11,5 mL de heparina 5 mg / mL de cónica. </li><li> Loja como 50 uL ou 250 ul de aliquotas a -80 ° C. </li></ul></td></tr><tr><td> Factor de Crescimento Epidérmico (EGF) </td><td></td><td></td><td><ul><li> Concentração aliquota de 20 ug / ml </li><li> Para 200 ug: Adicione 1 ml estéril DMEM (Gibco 11965-118) e 200 ug de EGF. Transferência para 15 mL cónico e adicionar 9 ml de DMEM. </li><li> Para 500 jig: Adicione 1 ml estéril DMEM (Gibco 11965-118) e 200 ug de EGF. Transferência para 50 mL cónico e adicionar 24 mL de DMEM. <li> Armazenar até 50 &amp; mu; L ou 250 ul de aliquotas a -80 ° C. </li></ul></td></tr><tr><td> Heparina </td><td></td><td></td><td><ul><li> Concentração alíquota de 5 mg / ml </li><li> Pesar 100 mg heparina. </li><li> Adicionam-se 100 mg de heparina a 20 ml (70%) DMEM (30%) F12-(1%), PSA (14 mL DMEM, F12 6 mL, 200 mL de PSA) </li><li> Filtro estéril </li><li> Loja como 50 uL ou 250 ul de aliquotas a -80 ° C </li></ul></td></tr><tr><td> su-8 fotorresiste </td><td> Microchem </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Silício punho </td><td> Materiais WRS </td><td> 3P01-5SSP-INV </td><td></td></tr><tr><td> tricloro-(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) silano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448931 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS Sylgard 184 </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> laminina </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td> 50 ug /ml em tampão PBS para a concentração final </td></tr><tr><td> Biostation IM </td><td> Nikon instrumentos </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging

Nos últimos 40 anos, os Estados Unidos investiram mais de 200 bilhões de dólares em pesquisa de câncer, resultando em apenas uma redução de 5% na taxa de mortalidade. Um dos principais obstáculos para melhorar os resultados dos pacientes é a má compreensão dos mecanismos subjacentes à migração celular associada com metástase invasão agressiva de células de câncer, e resistência à terapêutica 1. Glioblastoma multiforme (GBM), o mais prevalente tumor cerebral maligno primário adulto 2, exemplifica esta dificuldade. Apesar padrão cirurgia, radiação e quimioterapia, a sobrevida média do paciente é de apenas 15 meses, devido à infiltração GBM agressivo no cérebro adjacente e recorrência do câncer rápida 2. As interações de mecanismos celulares aberrantes migratórias e do microambiente tumoral provável diferenciar o câncer das células normais 3. Assim, a melhoria de abordagens terapêuticas para GBM exigir uma melhor compreensão dos mecanismos de migração de células de cancro. Trabalhos recentes sugerem thata pequena subpopulação de células dentro de GBM, do cérebro de células-tronco do tumor (BTSC), podem ser responsáveis ​​pela resistência à terapêutica e de recorrência. Mecanismos subjacentes capacidade migratória BTSC estão apenas começando a ser 1,4 caracterizados. Devido a uma limitação na inspecção visual e a manipulação geométrica, os ensaios de migração convencionais 5 estão restritos a quantificar as populações de células totais. Em contraste, dispositivos microfluídicos permitir uma análise única célula por causa da compatibilidade com microscopia moderna e controle sobre micro-ambiente 6-9. Nós apresentamos um método para caracterização detalhada de BTSC migração usando compartimentar dispositivos microfluídicos. Estes dispositivos PDMS-feitas lançar o meio de cultura de tecidos em três compartimentos conectados: semeando câmara, câmara receptora e ponte microcanais. Nós adaptado o dispositivo de tal forma que ambas as câmaras segurar meios suficientes para apoiar BTSC viável para 4-5 days sem troca de mídia. BTSCs altamente móveis inicialmente introduzidos na câmara de sementeira são isolados após a migração embora bridging microcanais para a câmara de recepção paralela. Esta migração simula a propagação do cancro celular através dos espaços intersticiais do cérebro. As imagens de fase ao vivo da morfologia celular durante a migração são registrados durante vários dias. BTSC altamente migratório pode, portanto, ser isolado, recultivadas, e analisadas mais. Microfluídica compartimentar pode ser uma plataforma versátil para estudar o comportamento migratório de BTSCs e outras células-tronco cancerosas. Através da combinação de geradores de gradiente, manuseamento de fluido, micro-eléctrodos e de outros módulos microfluidicos, estes dispositivos podem também ser utilizados para o rastreio de drogas e diagnóstico da doença 6. Isolamento de uma subpopulação de células migratórias agressivo permitirão estudos de mecanismos moleculares subjacentes.

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Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

Um dispositivo de microfluidos para a investigação de compartimentalizar cancro migração de células estaminais é descrito. Esta plataforma inovadora cria um microambiente viável celular e permite a visualização microscópica de locomoção de células vivas. Altamente móveis células cancerosas são isolados para estudar os mecanismos moleculares de infiltração agressiva, levando potencialmente a terapias mais eficazes no futuro.

Avaliação do Câncer de Migração Stem Cell Usando compartimentar dispositivos microfluídicos e imagens de células vivas

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

25.2K visualizações.  University of Wisconsin-Madison. Um dispositivo de microfluidos para a investigação de compartimentalizar cancro migração de células estaminais é descrito. Esta plataforma inovadora cria um microambiente viável celular e permite a visualização microscópica de locomoção de células vivas. Altamente móveis células cancerosas são isolados para estudar os mecanismos moleculares de infiltração agressiva, levando potencialmente a terapias mais eficazes no futuro.

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Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Medicina

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modelagem e imagem 3-Dimensional Invasion cela coletiva

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

Modelos MAME para formação de imagens 4D Live-célula do tumor: Interações microambiente que a progressão de Impacto maligno

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Processamento de tecido primário do tumor cerebral para Ensaios de Células Tronco e Fluxo de Classificando

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

In organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is indispensable for proper physiological function, and the formation and maintenance of these structures is a highly regulated process. The analysis of these complex, 3-dimensional structures has greatly depended on either 2-dimensional examination in section or on dye injection studies. These techniques, however, are not able to provide a complete and quantifiable representation of the ductal or vascular structures they are intended to elucidate. Alternatively, the nature of 3-dimensional plastic resin casts generates a permanent snapshot of the system and is a novel and widely useful technique for visualizing and quantifying 3-dimensional structures and networks.
A crucial advantage of the resin casting system is the ability to determine the intact and connected, or communicating, structure of a blood vessel or duct. The structure of vascular and ductal networks are crucial for organ function, and this technique has the potential to aid study of vascular and ductal networks in several ways. Resin casting may be used to analyze normal morphology and functional architecture of a luminal structure, identify developmental morphogenetic changes, and uncover morphological differences in tissue architecture between normal and disease states. Previous work has utilized resin casting to study, for example, architectural and functional defects within the mouse intrahepatic bile duct system that were not reflected in 2-dimensional analysis of the structure1,2, alterations in brain vasculature of a Alzheimer's disease mouse model3, portal vein abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic mice4, developmental steps in rat lymphatic maturation between immature and adult lungs5, immediate microvascular changes in the rat liver, pancreas, and kidney in response in to chemical injury6.
Here we present a method of generating a 3-dimensional resin cast of a mouse vascular or ductal network, focusing specifically on the portal vein and intrahepatic bile duct. These casts can be visualized by clearing or macerating the tissue and can then be analyzed. This technique can be applied to virtually any vascular or ductal system and would be directly applicable to any study inquiring into the development, function, maintenance, or injury of a 3-dimensional ductal or vascular structure.

A method of visualizing and quantifying the 3-dimensional structure of mouse hepatic portal vein or intrahepatic bile duct is described. This resin cast technique can also be applied to other ductal or vascular systems and allows for in situ visualization or quantification of a system's intact communicating architecture.

3-Dimensional Fundição de resina e Imagem da Veia Rato Portal ou Sistema intra-hepática Duto Biliar

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

A morte celular associada com mitose anormal observado por imagem confocal em células vivas Câncer

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Enriquecimento para resistente à quimioterapia do cancro do ovário células-tronco de linhas de células humanas

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.