Usando este protocolo, podemos facilmente produzir um grande número de flavonols de flavanones em uma panela. Esta técnica é de economia de mão-de-obra e tempo, altamente econômica e fácil de controlar, por isso tem um enorme potencial de industrialização. Sim, este método pode fornecer insights sobre a produção econômica de outros metabólitos secundários, mas precisa de algumas modificações quando aplicado a ele.
Ele geralmente não terá nada ou muito baixo rendimento. Meu conselho é lidar com enzimas recombinantes no gelo e adicionar 10% de glicerina à solução de estoque de enzimas. Isso porque somente através da demonstração visual uma nova mão pode entender os detalhes importantes e a verdade que afetam a execução bem sucedida do experimento.
Primeiro prepare buffers. Faça duas vezes tampão sintético dissolvendo a quantidade apropriada de TRIS-base, ascorbate de sódio, ácido alfa cetoglutático em água desionizada e pipeta quantidade apropriada de glicerol para a solução. Use uma pipeta para adicionar ácido clorídrico para ajustar o pH para 7,2 e ajustar o volume adicionando água desionizada.
Armazene o tampão sintético duas vezes a quatro graus Celsius para uso futuro. Em seguida, faça uma solução de estoque 100 vezes dissolvendo heptahydrate de sulfato ferroso em água desionizada. Faça uma solução de estoque de flavonoid de 25 milimolas dissolvendo flavonoid em metanol, e armazene a solução a menos 20 graus Celsius.
O passo mais crítico é configurar um sistema sintético. Para configurar um sistema sintético para produzir um flavanol a partir de um flavanone, primeiro prepare o sistema sintético em um tubo de dois mililitros de acordo com os reagentes listados nesta tabela. Coloque o tubo aberto em um bloco de calor tremendo a 40 graus Celsius, a 600 rpm por quarenta minutos.
Depois disso, termine a reação adicionando 10 microliters de ácido acético, e 100 microliters de acetato etílico. Duas horas depois, use uma pipeta para transferir a fase orgânica superior a um tubo de 1,5 mililitro, e coloque o tubo em um capô para secar o ar à temperatura ambiente. Para realizar a análise tlc, primeiro recupere os tubos do capô, e ressolar o pó flavanoid em 160 microliters de metanol em um tubo.
Prepare amostras flavonoides autênticas com concentrações seriais, diluindo a solução de estoque flavonoide de 25 milimolas em metanol. Carregue um microliter da amostra de reação redissolved, e um microliter da autêntica amostra flavonoid, em uma placa de poliamida. Faça o mesmo para as outras concentrações de flavonoid autêntico na mesma placa.
Em seguida, em um capô de fumaça, coloque a placa carregada da amostra em um cilindro de cromatografia preenchido com um sistema solvente. Coloque a placa na parte inferior do cilindro e execute a placa no sistema de solventes por 20 minutos. O ar secou as placas à temperatura ambiente.
Com uma garrafa de pulverizador, pulverize as placas com solução 1% etanolica de cloreto de alumínio, seguido de secagem de ar novamente à temperatura ambiente por 30 minutos. Visualize as manchas nas placas sob uma luz UV a 254 nanômetros, e tire imagens, em seguida, no computador, abra o software ImageJ. Clique no arquivo, abra, para abrir a imagem a ser analisada.
Clique na ferramenta de seleção mais retangular à esquerda na interface do usuário ImageJ. Delineie o ROI na imagem com o mouse e pressione um para rotular o primeiro ROI. Mova a seleção retangular com o mouse direto para o próximo ROI, e pressione dois para rotular o segundo ROI.
Repita para rotular todos os outros ROIs pressionando dois. Pressione três para gerar gráficos de perfil para todos os ROIs, em uma janela pop-up. Em seguida, use a ferramenta de seleção em linha reta para soltar linhas de base de modo a definir uma área fechada para cada pico de interesse.
Ative a ferramenta varinha, clicando no ícone correspondente na interface de usuário ImageJ. Clique dentro do pico para exibir resultados para todos os picos em uma janela pop-up. Em seguida, no Excel, plote os valores cinzentos da janela pop-up contra as concentrações flavonoides correspondentes, para fazer uma curva padrão baseada em TLC do flavonoid autêntico.
Em seguida, calcule o rendimento do flavonoide de interesse produzido neste protocolo, de acordo com a fórmula resultante. Use uma seringa para processar cada amostra sequencialmente através de um filtro de 0,45 micrômetro e 0,22 micrômetros. Carregue as amostras em um sistema HPLC-MS através do bocal de sucção e separe as amostras a 30 graus Celsius usando uma coluna C18.
Elute a coluna a um mililitro por minuto por um gradiente de 10 a 85 volume por cento de nitrito de acetil na água, e monitore a absorvância do eluado de 200 a 800 nanômetros. Realize a análise LC-MS em um modo de íon negativo, com um fluxo de nitrogênio seco de 10 litros por minuto a 300 graus Celsius, em um fluxo de gás de bainha de sete litros por minuto a 250 graus Celsius, e colete dados usando um software incorporado. Para extrair cromatógrafos de comprimento de onda único, abra o programa de análise qualitativa e clique em arquivo, abra o arquivo de dados.
Selecione o arquivo a ser analisado na janela de arquivo de dados aberto e clique em abrir para abrir o arquivo. Clique com o botão direito do mouse na janela de resultados do cromatograma e, em seguida, extraia cromatogramas em um menu pop-up. Na lista de tipos, clique em outros cromatogramas.
Na caixa de combinação do detector, selecione DAD1 e clique bem para exibir os resultados do HPLC na janela de resultados do cromatograma. Clique no ícone de integração manual encaixado na parte superior da janela de resultados do cromatograma. Desenhe a linha de base para o pico necessário para análise de integração manual com o mouse.
Clique em exibir, lista de picos de integração, para exibir os resultados. Copie os resultados das áreas de pico para Excel e trace uma curva padrão baseada em HPLC do flavonoide autêntico contra as concentrações flavonoides correspondentes, então calcule o rendimento do flavonoide de interesse produzido neste protocolo de acordo com a fórmula resultante. Em seguida, repita os mesmos procedimentos para extrair cromatogramas de comprimento de onda único para analisar os dados de MS para a massa exata de compostos flavonoides.
Clique no ícone de seleção de intervalo na barra de ferramentas de resultados do cromatograma. Selecione o pico de interesse. Clique com o botão direito do mouse na faixa selecionada e clique no espectro MS do extrato no menu pop-up para exibir os resultados na janela de resultados do espectro MS.
Para determinar se este sistema in vitro pode ser usado para a conversão de um flavanone em um flavonol, nRN foi adicionado ao sistema. Havia duas novas manchas emergindo em uma placa de poliamida TLC. Um ponto mostrou uma distância de migração semelhante à da DHK, e as outras semelhantes à do KMF.
Análises adicionais do HPLC e da LC-MS demonstraram que o novo produto químico mostrou um tempo de retenção de 12 minutos e 20 minutos, respectivamente, em um pico de íon quase molecular M sobre Z em 287 e 285 idênticos aos de DHK e KMF. Para determinar se o sistema pode ser usado para a conversão de outros flavanones em seus flavonols correspondentes, o ERD foi adicionado ao sistema. Duas novas manchas em uma placa TLC de poliamida apresentaram uma distância de migração semelhante à de DHQ e QRC, respectivamente.
As análises de HPLC e LC-MS demonstraram que esses novos produtos químicos revelaram um tempo de retenção de 10 minutos e 16 minutos, respectivamente, e um pico de íons quase moleculares M sobre Z em 303 e 301, que correspondiam exatamente aos de DHQ e QRC. Ao preparar o sistema sintético, você deve adicionar a enzima por último, e adicionar o sulfato ferroso de segundo para o último. Sim, fornece um guia para a produção econômica de outros metabólitos secundários.
