Atualmente, a imunohistoquímica é utilizada com frequência crescente para identificar a presença de marcadores moleculares específicos e suas alterações no caso de patologias, dando raiz à possibilidade de realização de análise quantitativa. A imunohistoquímica, principalmente a técnica de imunofluorescência, é usada no modelo animal larval e zebrafish adulto, mas pouco se sabe sobre um bom protocolo imunohistoquímico padrão para zebrafish. Aqui, descrevemos e ilustramos um protocolo que pode ser usado para estudar a conservação evolutiva de proteínas importantes em zebrafish adultos.
Um bom protocolo para imunohistoquímica em zebrafish adulto pode ajudar a fundamentar a utilidade deste modelo animal para estudar a expressão morfológica e a distribuição de biomoléculas altamente conservadas. Este método também pode ajudar a analisar possíveis alterações dessas biomoléculas devido a condições patológicas correlacionadas à fisiopatologia humana. Demonstrando o procedimento será a Dra.
Para iniciar este procedimento, transfira os blocos de tecido congelado preparados para um criostat a menos 20 graus Celsius. Corte o bloco em seções coronais ou sagiais de 10 micrômetros. Em seguida, colete os tecidos em seções seriais alternativas em lâminas de vidro adesivos adequadas para a imunohistoquímica, e armazene-os a menos 20 graus Celsius até que estejam prontos para prosseguir.
Primeiro, use uma caneta resistente a solventes para demarcar a área de tecido na lâmina. Enxágüe as seções três vezes por cinco minutos cada, usando tampão fosfato de 0,1 molar. Em seguida, dissolva 0,3 mililitros de Triton X-100 em 100 mililitros de tampão fosfato de 0,1 molar para preparar Triton X-100 0,3%Dissolver 0,1% soro de burro normal em tampão fosfato contendo 0,3% Triton X-100 para preparar a solução de bloqueio.
Incubar as seções com a solução de soro de burro normal dissolvido no tampão de permeabilização PB-Triton X-100 0,3% durante 30 minutos à temperatura ambiente para permeabiliizar a membrana celular e bloquear os locais de ligação inespecíficos. Primeiro, enxágüe as seções três vezes por cinco minutos cada com tampão fosfato molar de 0,1. Adicione a mistura de anticorpos primários diluídos em PB-T, e incubar as seções durante a noite em uma caixa úmida à temperatura ambiente.
No dia seguinte, enxágue as seções três vezes por cinco minutos cada com tampão fosfato de 0,1 molar. Incubar seções em temperatura ambiente por duas horas em uma mistura apropriada de anticorpos secundários diluídos em PB-T. Para começar, enxágüe as seções três vezes por cinco minutos cada uma com tampão fosfato de 0,1 molar.
Dissolva 1,5 microliters de DAPI em três mililitros de tampão fosfato para preparar o DAPI de corante nuclear. Contra-retenham as seções no corante. Em seguida, use o meio de montagem para cobrir os slides para estabilizar o tecido e a mancha para uso a longo prazo.
Amostras fluorescentes podem ser armazenadas no escuro a quatro graus Celsius. Repita o protocolo de imunofluorescência e omita o anticorpo primário ou secundário, ou substitua o antiserum primário ou secundário com tampão fosfato para preparar o controle negativo. Em seguida, repita o protocolo de imunofluorescência e pré-absorva cada anticorpo primário com um excesso do peptídeo relativo.
Repita o protocolo de imunofluorescência em fatias do cérebro do rato para preparar o controle positivo. Usando um microscópio confocal equipado com um estágio motorizado X-Y-Z, uma câmera digital e software de aquisição e análise, observe e analise as seções imunossuadas. Adquira imagens digitais com os objetivos 5x, 20x e 40x.
Tire imagens de cada seção com baixa ampliação em cada um dos canais disponíveis para compor uma montagem de baixa ampliação. Normalize as imagens de fluorescência ao máximo de contraste e sobreposição. Em toda a área de interesse, colete pilhas de imagens Z em série através de seis planos focais com passos focais de um a 1,8 micrômetros.
Execute esta coleção para cada canal separadamente. Depois disso, use o software de desconvolução de imagens para desconvolver imagens por aplicação de 10 iterações e colapsar as imagens de plano Z em série em uma única imagem de projeção máxima. Use um software de edição de imagem apropriado para ajustar os micrografos para luz e contraste.
A análise imunohistoquímica da distribuição ox-A e OX-2R no intestino de zebrafish adulto mostra diferentes locais de localização de OX-A e OX-2R e seus aumentos de expressão nas células intestinais do DIO zebrafish. Uma mancha marrom intensa para OX-A é observada nas células do intestino medial e anterior. A imunoexpressão do OX-A dá sinais claros nos diferentes compartimentos intestinais, diminuindo do anterior em direção ao intestino medial.
Resultados semelhantes são observados para a imunoexpressão OX-2R no intestino do DIO e controle de zebrafish diet. Um sinal ox-A aumentado em DIO zebrafish adulto é acompanhado pela superexpressão de OX-2R em outros compartimentos intestinais. A análise precisa das imagens imunofluorescentes mostra o aumento da colocalização ox-2R/CB1R no intestino de zebrafish adulto DIO em comparação com a dieta de controle zebrafish.
Situação semelhante é observada em diferentes regiões cerebrais, como o telencephalon dorsal, hipotálamo, tectum óptico, torus lateralis e núcleo difuso do lobo inferior. Ao dobrar a imunostaining com a colocalização orexina-A e CB1R, observa-se que houve um aumento da colocalização nos neurônios orexinérgicos do hipotálamo, acompanhados de um aumento do sinal fluorescente orexina-A. Esses resultados mostram como a dupla imunofluorescência pode ajudar a identificar a expressão fisiologicamente conservada da proteína, a colocalização de proteínas-alvo e suas mudanças de distribuição e/ou expressão em diferentes condições patológicas.
Usando a imunofluorescência, podemos entender melhor a codistribução e coexpressão das biomoléculas, suas possíveis interações, e também podemos ter uma imagem visível de suas mudanças em caso de diferentes patologias. Além disso, a distribuição neuroanatomical da expressão ou receptores de enzimas metabólicas pode revelar ainda mais o papel da sinalização proteica dentro dos tecidos. O presente trabalho técnico introduziu a abordagem da imunofluorescência para estudar dois sistemas altamente conservados, orexina e endocanabinóides, no uso de um modelo adulto de zebrafish.
Usando este protocolo descrito aqui pela primeira vez no cérebro de zebrafish adulto, a distribuição anatômica e coexpressão de receptores orexin-2 e os receptores endocanabinóide-CB1 não foi determinada. Recomendamos os protocolos descritos aqui para experimentos de imunohistoquímica e para detectar distribuição espacial e organização de receptores em peptídeos em zebrafish adultos para entender melhor suas funções.
