Este trabalho foi apoiado por uma Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde Fase 1 Clínico-Scientist Award (AG) de e uma subvenção de funcionamento da Sociedade de Pesquisa do Câncer (AG). Os autores agradecem ao Dr. John Dick por seu apoio a este projeto.

Uma visão geral esquemática do protocolo é apresentado na Figura 1. 1. Processamento das Amostras HCC Humano Obter espécimes HCC humana primárias com o consentimento do paciente por escrito e com a aprovação do conselho de ética em pesquisa institucional. Estes protocolos têm sido realizados em nossa instituição com a aprovação do Conselho de Ética de Pesquisa University Health Network, em conformidade com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano. Coletar amostras de CHC frescos o mais rápido possível após o procedimento cirúrgico, uma vez amostras adequadas sejam tomadas para fins clínicos. Idealmente, esta deverá ter lugar dentro de 30 minutos após a retirada do tecido do paciente. Tal como ilustrado na Figura 2, uma amostra de, pelo menos, 1 cm 3 obtidos a partir da periferia do tumor é o ideal, como a parte central do tumor pode ser necrótico.Os tumores que não receberam qualquer tratamento antes de ressecção tais como a radiação, quimioterapia, ou ablação são preferidos, a fim de maximizar a probabilidade de que as células tumorais são viáveis. Lidar com tecidos humanos primários, de acordo com os protocolos de proteção individual padrão para material de risco biológico. Realize todas as manipulações laboratoriais de tecidos tumorais e preparações de células em uma cabine de segurança biológica classe II usando técnicas assépticas. <ol><li> Colocar a amostra HCC fresco em 10-25 ml Modified Eagle Médium F12 / &#39;s Ham de Dulbecco isento de soro, a 4 ° C e transferir em gelo para o laboratório para processamento imediato e preparação de fragmentos de tecidos e / ou células de xeno-enxerto em ratinhos. </li><li> Utilizando fórceps estéreis, colocar a amostra de tumor em 100 mm x 20 mm numa caixa de Petri ou outra superfície de trabalho estéril adequado. Dividir a amostra tumoral em fragmentos de cerca de 2-3 mm 3, usando uma lâmina de bisturi cirúrgico No.10. Neste ponto, considere o snap-congelamento ou de fixação de formalina some fragmentos do tumor para outros experimentos ou análises, conforme necessário. </li><li> Para fragmentos de tumor de xeno-enxerto, colocar alguns dos fragmentos de HCC em um ou mais tubos de microcentrífuga contendo Matrigel suficiente para permitir que os fragmentos de permanecer submerso. Mantenha estes tubos no gelo. </li><li> Para a preparação de uma suspensão de células de tumor, utilizar a lâmina de bisturi cirúrgico para picar o tecido HCC remanescente tanto quanto possível e misturar-se com 5-10 ml de DMEM-F12 em um tubo de 50 ml, dependendo do volume do tecido moído. </li><li> Adicionar colagenase tipo IV e dispase II a concentrações finais de 200 unidades / ml e 0,8 unidades / ml, respectivamente. Pipeta a mistura para cima e para baixo bem com uma pipeta de 25 ml. </li><li> Veda-se o tubo e incubar a mistura a partir do passo 1.6 a 37 ° C numa incubadora de dióxido de carbono a 5% durante 30-60 minutos, dependendo da suavidade do tecido do tumor. Pipeta a mistura para cima e para baixo algumas vezes a cada 10 minutos para avaliar o progresso da digestão enzimática. </li><li> Depois de digestion estiver concluída, passar a solução tumor através de um filtro de células 100 m. Suavemente triturar o tecido remanescente no filtro celular utilizando uma ponta de pipeta de 25 ml, ao permitir que o número máximo de células tumorais para passar. Coletar a suspensão de células tensas em um tubo cônico de 15 ml. </li><li> Centrifugar a suspensão de células do tumor a 1.200 rpm durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Delicadamente, decantar o sobrenadante. Dependendo do tamanho da pílula, adicionar 2-5 mL de gelo frio 1x de glóbulos vermelhos (RBC) de tampão de lise e suavemente pipetar para cima e para baixo para ressuspender o sedimento. Mantenha no gelo por 5 min. </li><li> Adicionar DMEM-F12 para um volume total de 15 ml e centrifugar a 1000 rpm durante 5 min a 4 ° C para lavar o tampão de lise dos glóbulos vermelhos. </li><li> Delicadamente, decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento RBC-livre de células tumorais em DMEM-F12. </li><li> Contar as células viáveis ​​utilizando a exclusão de azul de tripano, manualmente ou com um contador de células automatizado. </li><li> Alíquotas de células de tumor de centrífuga contendo o desejado number de células por injecção, tal como descrito acima, ressuspender o sedimento de células resultante em 30 mL de gelo-Matrigel frio, e armazenar em gelo. </li></ol> Opcional: Depois do passo 1.11, rotineiramente depleção das células humanas CD45 + (leucócitos) a partir da suspensão de células de tumor em massa e / ou purificar os subconjuntos de células tumorais utilizando a citometria de fluxo ou esferas imunomagnéticas. Os protocolos detalhados para estas técnicas são bem descritos pelos fabricantes dos anticorpos relevantes, grânulos, e citómetros de fluxo. Nota: O protocolo descrito acima podem também ser utilizadas para efectuar a xenoenxertos de tumores humanos colhidos a partir de ratinhos, a fim de realizar o transplante em série, substituindo o tecido de xenoenxerto para o tecido HCC humana primária no passo 1.1. Nesta situação, após o passo 1.11, rotineiramente esgotar células infiltrantes de murino a partir da suspensão das células usando um anticorpo contra o antigénio de rato histocompatibilidade H2K. 2.Xeno Realizar todos os procedimentos com animais, em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comitê de cuidados com os animais institucional. Os procedimentos aqui descritos foram cumpridos ao abrigo de algum Uso de Animais protocolo aprovado pelo Comitê Animal Care da University Health Network, nos termos e de conformidade com todas as agências relevantes regulatórios e institucionais, regulamentos e diretrizes. Equipamentos para a entrega de agentes anestésicos voláteis inalatórios para animais de pequeno porte devem ser utilizados de acordo com os procedimentos operacionais padrão do biotério e instituto de pesquisa. Realizar todos os procedimentos cirúrgicos, utilizando técnica asséptica e instrumentos esterilizados em uma cabine de segurança biológica classe II. Utilizar não obesos imunodeficiência combinada severa diabético (NOD / SCID) ou NOD / SCID / interleucina 2 do receptor gama cadeia nulos (NSG) estirpes de ratinhos de ambos os sexos, em 6-8 semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 9,10. Estescamundongos devem ser alojados e mantidos em um local capaz de proporcionar condições isentos de agentes patogénicos adequados para animais imunodeficientes. Preparar para cirurgia ratos numa câmara fornecer a 5% (v / v) de isoflurano inalado em 1 L / min de oxigénio. Manter a anestesia até que haja perda de reflexo corneal e dedo do pé no animal (s). Para xeno subcutânea, raspar uma ou mais pequenas áreas no dorso do animal (s) e limpar a pele com etanol a 70%. Para xeno intra-hepática, raspar o tórax e abdômen ventral do animal (s) a partir da axila até a região inguinal e limpar a pele com etanol 70%. 2.1 implante subcutâneo de fragmentos do tumor <ol><li> Colocar o rato anestesiado deitado, mantém a anestesia por inalação de isoflurano (2% (v / v) em 1 L / min de O2) com um bocal. Aplicar Tear-Gel para proteger os olhos do animal de lesão traumática. </li><li> Esterilizar a zona dorsal rapada (s) com Betadinelimpeza cirúrgica seguido de etanol a 70% e por fim com uma solução de povidona-iodo. </li><li> Faça uma incisão na pele 5 milímetros usando uma tesoura afiada estéreis. </li><li> Inserir uma tesoura sem corte fechou suavemente no espaço subcutâneo e espalhar com cuidado para desenvolver um bolso grande o suficiente para acomodar um fragmento de tumor. </li><li> Insira o fragmento de tumor preparada no passo 1.3 na bolsa subcutânea usando uma pinça fina estéreis. </li><li> Feche a incisão na pele com suturas ou grampos. </li><li> Prestar cuidados no pós-operatório para o mouse, conforme descrito abaixo. </li></ol> 2.2 A injecção subcutânea de células tumorais <ol><li> Prepare o animal conforme descrito nos passos 2.1.1 e 2.1.2. </li><li> Carregar a suspensão de células de tumor em Matrigel preparados no passo 1.13 a uma seringa de insulina com uma 29 G 1/2 em agulha. </li><li> Inserir a agulha no espaço subcutâneo e descarregar o conteúdo da seringa. Avançando a agulha alguns milímetros ao longo do plano subcutâneo distância from o local da punção da pele impede a fuga de suspensão de células do tumor para fora do local da punção após a retirada da agulha. </li><li> Prestar cuidados no pós-operatório para o mouse, conforme descrito abaixo. </li></ol> 2.3 Implantação de fragmentos do tumor intra-hepática <ol><li> Usando um 27 G 1/2 na agulha em uma seringa de 1 ml, administrar 350 mL de estéril por via subcutânea normal de solução salina no dorso do pescoço do animal anestesiado para compensar as perdas de fluido intra-operatórias. Para analgesia, administrar 350 ul de solução salina estéril normal contendo buprenorfina (0,1 mg / kg) por via subcutânea no flanco do animal, usando um 1/2-in agulha 27 G e seringa de 1 ml. </li><li> Colocar o rato supina sobre um tapete de pré-aquecida, com o nariz e a boca posicionado dentro do bocal para proporcionar manutenção da anestesia por inalação de isoflurano (2% (v / v) em 1 L / min de O2). </li><li> Estenda as pernas e prenda-os com fita adesiva a superfície de operação para otimizar a exposição deabdômen ventral e tórax. </li><li> Realize o procedimento em uma lente de aumento para otimizar a visualização. </li><li> Esterilizar a pele rapada no abdómen e do tórax ventral com limpeza cirúrgica Betadine seguido de etanol a 70% e por fim com uma solução de povidona-iodo. </li><li> Usando uma tesoura afiada estéreis, fazer uma incisão na pele subcostal bilateral transversal e dividir as camadas musculares para entrar na cavidade peritoneal para permitir a exposição adequada de todo o fígado. </li><li> Coloque um ponto na pele acima do apêndice xifóide e prendê-lo para o bocal com fita adesiva, de modo a permitir uma melhor exposição do fígado e estruturas adjacentes. </li><li> Use dois aplicadores com ponta de algodão adjacentes e posterior ao fígado para estabilizá-lo. </li><li> Fazer uma incisão de 3 mm de comprimento e profundidade na superfície do fígado usando uma lâmina de bisturi número 10 estéril. </li><li> Aplique imediatamente Surgicel e pressão suave para o local da incisão para alcançar a hemostasia; remover após 60-90 sege prosseguir somente se a hemostasia completa foi alcançada. </li><li> Coloque um fragmento de tumor passo 1.3 na incisão do fígado com uma pinça fina estéreis ou com uma agulha de 18 G. </li><li> Aplicar um pequeno pedaço de Surgicel sobre a incisão no fígado para impedir o deslocamento do fragmento de tumor e garantir a hemostase continuação. </li><li> Feche a incisão com suturas ou grampos. </li><li> Prestar cuidados no pós-operatório, conforme descrito abaixo </li></ol> 2.4 Implantação intra-hepática de células tumorais através de injecção directa no fígado <ol><li> Prepare o mouse como descrito nos passos 2.3.1 a 2.3.7 supra. </li><li> Carregar a suspensão de células tumorais (preparado no passo 1.13) para uma seringa de insulina usando um 29 G 1/2 em agulha. </li><li> Com o fígado estabilizado usando um aplicador de algodão-ponta, insira a agulha de seringa de insulina no fígado e promover a ponta alguns milímetros fora do local da punção longo de um plano subcapsular. </li><li> Suavemente descarregar o conteúdo da seringa e tuando remover a agulha do fígado. </li><li> Local Surgicel sobre o local da punção e aplique uma leve pressão com um aplicador com ponta de algodão para evitar a fuga de suspensão de células do tumor e para alcançar a hemostasia completa. </li><li> Feche a incisão com suturas ou clipes e fornecer cuidados pós-operatórios, conforme descrito abaixo. </li></ol> 2.5 xeno intra-hepática de células tumorais via injeção no Baço <ol><li> Prepare o mouse conforme descrito nos passos 2.3.1 a 2.3.5 supra. </li><li> Usando uma tesoura afiada estéreis, fazer um 1 cm à esquerda incisão subcostal para entrar na cavidade peritoneal. </li><li> Use um aplicador com ponta de algodão para refletir o estômago cranial e para o lado direito do animal, a fim de expor o baço. </li><li> Ao manipular os tecidos adiposos circundantes com uma pinça atraumática finas estéreis, entregar o baço na incisão e colocar um aplicador com ponta de algodão atrás do baço para estabilizá-lo. </li><li> Usando 5-0 fio de seda, lugarum nó pré-amarrado solto em torno do baço acima do pólo inferior. </li><li> Carregar a suspensão de células tumorais (preparado no passo 1.13) para uma seringa de insulina usando um 29 G 1/2 em agulha. </li><li> Insira a agulha de seringa de insulina para o pólo inferior do baço e avançá-lo passado, o nível do nó pré-amarrado solto. </li><li> Descarregam-se lentamente o conteúdo da seringa, retirar a agulha do baço, e apertar o nó para evitar qualquer fuga da suspensão de células de tumor injectadas. </li><li> Substituir o baço para a cavidade peritoneal. </li><li> Feche a incisão com suturas ou clipes e fornecer cuidados pós-operatórios, conforme descrito abaixo. </li></ol> 2.6 hepatectomia parcial para Facilitar intra-hepática enxerto de tecido tumoral Humano <ol><li> Prepare o mouse conforme descrito nos passos 2.3.1 a 2.3.7. </li><li> Com uma tesoura afiada estéreis, dividir o ligamento falciforme ligado ao lóbulo médio do fígado. </li><li> Usando um aplicador com ponta de algodão, mobilizaro lobo esquerdo do fígado e a posição de um nó pré-atado solta de seda de sutura 5-0 em torno do lóbulo esquerdo. Avançar o nó frouxo o mais próximo possível para o pedículo Bilio-vascular do lobo esquerdo e apertar o nó. </li><li> Extirpar o lóbulo esquerdo distal à ligadura com uma tesoura estéril, deixando um pequeno toco para evitar o deslizamento do nó e hemorragia subseqüente. </li><li> Utilizando uma técnica similar, ligadura e ressecar a maioria do lóbulo médio do fígado, evitando a vesícula. </li><li> Use Surgicel e uma leve pressão com um aplicador com ponta de algodão ao longo das superfícies de corte do parênquima hepático de hemostasia completa. </li><li> Para xeno intra-hepática de um fragmento de tumor ou células de tumor, prosseguir com os passos 2.3.8 a 2.3.11 ou 2.4.2 a 2.4.5, tal como descrito acima. </li><li> Para xeno intra-hepática de células tumorais através da injeção do baço, utilizam aplicadores com ponta de algodão para refletir cuidadosamente o estômago cranial e para o lado direito do animal, exposing do baço. Continuar com passos 2.5.4 a 2.5.9, tal como descrito acima. </li><li> Feche a incisão com suturas ou clipes e fornecer cuidados pós-operatórios, conforme descrito abaixo. </li></ol> 2.7 Cuidados no pós-operatório <ol><li> Retire o mouse a partir do bocal anestesia inalatória. </li><li> Posicione o mouse em uma gaiola sob uma lâmpada de calor por aproximadamente 20 min até a recuperação da anestesia e mobilizar plenamente. </li><li> Repetir a dose de buprenorfina cada 8-12 horas durante os primeiros 2-3 dias pós-operatórios. </li></ol>

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	<li>El-Serag, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma.">Hepatocellular carcinoma.</a> N. Engl. J. Med. 365, 1118-1127 (2011).</li><li>Li, Y., Tang, Z. Y., Hou, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma:+insight+from+animal+models.">Hepatocellular carcinoma: insight from animal models.</a> Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 32-43 (2012).</li><li>Tateishi, R., Omata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma+in+2011:+Genomics+in+hepatocellular+carcinoma--a+big+step+forward.">Hepatocellular carcinoma in 2011: Genomics in hepatocellular carcinoma--a big step forward.</a> Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 69-70 (2012).</li><li>Hoshida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+classification+and+novel+targets+in+hepatocellular+carcinoma:+recent+advancements.">Molecular classification and novel targets in hepatocellular carcinoma: recent advancements.</a> Semin. Liver Dis. 30, 35-51 (2010).</li><li>Ji, J., Wang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+cancer+stem+cell+biology+in+hepatocellular+carcinoma.">Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma.</a> Semin. Oncol. 39, 461-472 (2012).</li><li>Villanueva, A., Hernandez-Gea, V., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+therapies+for+hepatocellular+carcinoma:+a+critical+view+of+the+evidence.">Medical therapies for hepatocellular carcinoma: a critical view of the evidence.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2012).</li><li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+human+tumour+tissue+xenografts+in+immunodeficient+mice:+a+systematic+review.">Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review.</a> Clin. Transl. Oncol. 12, 473-480 (2010).</li><li>Sausville, E. A., Burger, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+human+tumor+xenografts+to+anticancer+drug+development.">Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development.</a> Cancer Res. 66, 3351-3354 (2006).</li><li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+defects+in+innate+and+adaptive+immunologic+function+in+NOD/LtSz-scid+mice.">Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice.</a> J. Immunol. 154, 180-191 (1995).</li><li>Ohbo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+hematopoiesis+in+mice+with+a+truncated+mutant+of+the+interleukin-2+receptor+gamma+chain.">Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain.</a> Blood. 87, 956-967 (1996).</li><li>Fiebig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vivo+imaging+of+the+murine+liver:+a+micro-computed+tomography-based+anatomical+study.">Three-dimensional in vivo imaging of the murine liver: a micro-computed tomography-based anatomical study.</a> PLoS One. 7, e31179 (2012).</li><li>Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cancer+cell+lines:+fact+and+fantasy.">Human cancer cell lines: fact and fantasy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 233-236 (2000).</li><li>Yamashita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpCAM-positive+hepatocellular+carcinoma+cells+are+tumor-initiating+cells+with+stem/progenitor+cell+features.">EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features.</a> Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).</li><li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-130b+Promotes+CD133(+)+liver+tumor-initiating+cell+growth+and+self-renewal+via+tumor+protein+53-induced+nuclear+protein+1.">miR-130b Promotes CD133(+) liver tumor-initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1.</a> Cell Stem Cell. 7, 694-707 (2011).</li><li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+CD90++cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer.">Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13, 153-166 (2008).</li><li>Park, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoangiogenesis+and+sinusoidal+"capillarization"+in+dysplastic+nodules+of+the+liver.">Neoangiogenesis and sinusoidal "capillarization" in dysplastic nodules of the liver.</a> Am. J. Surg. Pathol. 22, 656-662 (1998).</li><li>Sigurdson, E. R., Ridge, J. A., Kemeny, N., Daly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+and+liver+drug+uptake+following+hepatic+artery+and+portal+vein+infusion.">Tumor and liver drug uptake following hepatic artery and portal vein infusion.</a> J. Clin. Oncol. 5, 1836-1840 (1987).</li><li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2/3+partial+hepatectomy+in+mice.">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy:+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas.">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> Am. J. Pathol. 176, 2-13 (2010).</li><li>Zhang, D. Y., Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis-dependent+mechanisms+of+hepatocarcinogenesis.">Fibrosis-dependent mechanisms of hepatocarcinogenesis.</a> Hepatology. 56, 769-775 (1002).</li><li>Chen, K., Ahmed, S., Adeyi, O., Dick, J. E., Ghanekar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+solid+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice+are+vulnerable+to+lymphomagenesis+associated+with+Epstein-Barr+virus.">Human solid tumor xenografts in immunodeficient mice are vulnerable to lymphomagenesis associated with Epstein-Barr virus.</a> PLoS One. 7, e39294 (2012).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nós descrevemos uma variedade de técnicas para estabelecer subcutânea e intra xenoenxertos de carcinoma hepatocelular humano em ratinhos imunodeficientes que pode ser aplicado a uma ampla variedade de questões experimentais e ensaios. Enquanto xenoenxertos subcutâneos têm sido amplamente utilizados para o estudo de vários aspectos da biologia HCC, xenoenxertos intra raramente são descritos na literatura. Além disso, a maioria dos estudos que descrevem a utilização de xenoenxertos geraram estes a partir de lin...

O carcinoma hepatocelular (HCC) é o quinto tipo de câncer mais comum no mundo eo mais rapidamente crescente causa de morte por câncer na América do Norte. O fator de risco mais prevalente para HCC é a cirrose hepática, ocorrendo com mais freqüência devido a hepatite crônica viral, abuso de álcool, doença auto-imune, ou distúrbios metabólicos hereditários 1. Apesar da carga de doença pesada imposta pelo HCC em populações em todo o mundo, a fisiopatologia da HCC é relativamente mal entendido em comparação a outros cânceres comuns como colorretal, de mama ou câncer de próstata. Por exemplo, os eventos moleculares e celulares específicos tumorigenesis condução continuam a ser claramente definidas 2. Como a maioria dos cancros epiteliais sólidos, abordagens genómicas revelaram heterogeneidade nas aberrações associadas com HCC 3. Um certo número de estudos revelaram actividade desordenado de uma variedade de vias de sinalização envolvidos na proliferação celular, survência, diferenciação, e angiogénese 4. Além disso, o papel de células estaminais de cancro no HCC pathobiology ser esclarecido 5. Com uma compreensão limitada do HCC fisiopatologia, o arsenal de terapias eficazes para HCC também se manteve relativamente limitada. Pacientes em início de carreira com tumores confinados ao fígado são candidatos à terapia curativa com ablação do tumor ou ressecção cirúrgica, embora a recorrência é comum. Para pacientes com doença mais avançada, a quimioterapia ea radioterapia são de eficácia limitada e são usados ​​principalmente para o controle da doença com intenção paliativa 6. Alta qualidade in vivo modelos experimentais de HCC humana fornecer, assim, uma plataforma valiosa para a pesquisa básica muito necessária para a fisiopatologia da HCC humana, bem como para a avaliação de novas abordagens terapêuticas. Em comparação com a utilização de linhas celulares ou em modelos de rato altamente definidos, xenoenxertos de pritumores Maria humana em ratinhos imunodeficientes surgiram como ferramentas valiosas para tais estudos, uma vez que são capazes de recapitular a doença humana com alta fidelidade reflectindo também a heterogeneidade que se encontra presente no interior e entre os diferentes pacientes 7,8. Para este fim, temos desenvolvido uma variedade de métodos para estabelecer xenoenxertos de carcinoma hepatocelular humano em ratinhos imunodeficientes. Enquanto a maioria dos estudos publicados envolvendo xenografts HCC descrever o uso de linhas de células de carcinoma hepatocelular humano bem estabelecidas para esse fim, temos focado na otimização de nossos ensaios para gerar xenografts de espécimes HCC primários obtidos imediatamente após a ressecção cirúrgica de pacientes. Podem ser necessárias técnicas xeno diferentes para aplicações diferentes de pesquisa. Por exemplo, xenoenxertos subcutâneos gerados a partir de fragmentos de tumor são geradas rapidamente, são facilmente monitorizados, podendo ser mais apropriado para a administração local de novas terapias com convenientemonitoramento da resposta do tumor. Xenoenxertos intrahepáticos podem ser mais relevantes para os estudos relacionados com o papel do microambiente hepática em biologia HCC. Xenoenxertos gerados a partir de suspensões de células tumorais são necessários para a identificação e caracterização de subconjuntos de células de iniciação do tumor ou para experiências que requerem a manipulação in vitro de células tumorais antes de xenotransplante. Assim, temos desenvolvido e validado os seguintes protocolos para estabelecer subcutânea ou intra-hepáticos a partir de xenoenxertos de suspensões de células ou fragmentos de tumores derivados das amostras de carcinoma hepatocelular humano primárias.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Mod. Eagle Medium/Ham's F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12)</td>
			<td>WISENT Bioproducts</td>
			<td>319-075-CL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase TypeIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Buffered Formalin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>1011-L8001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine surgical scrub</td>
			<td>Purdue Pharma</td>
			<td>NPN 00158313</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LORIS 10% PVP-I Solution</td>
			<td>LERNA Pharma Inc.</td>
			<td>109-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>M60302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear-Gel</td>
			<td>Novartis Pharmaceuticals</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen section compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95057-838</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold, Tissue -Tek</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide Needle 18G 1 &frac12;</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide Needle 27G &frac12;</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>305109</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G&frac12;</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>309301</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade No.10</td>
			<td>Feather Safety Razor Co.</td>
			<td>08-916-5A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5-0 Soft silk surgical suture, 3/8" taper point needle</td>
			<td>Syneture</td>
			<td>VS-880</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore surgical tape</td>
			<td>3M Health care</td>
			<td>1577-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton applicator</td>
			<td>Medpro</td>
			<td>018-425</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgicel, oxidized regenerated cellulose</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1951</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 100 &mu;m nylon</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnification lighting with mobile base</td>
			<td>Benson medical Industries Inc.</td>
			<td>model: RLM-CLT-120V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish sterile 100x20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821474</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forcep, 1x2 teeth, 4-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A10-302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson dressing forcep 4-3/4"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A10-220</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye dressing forcep, serrated, straight, 4"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A19-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A12-142</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor, curved, 4-1/4"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A8-690</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor, straight, 4-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A8-684</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A17-228</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice

In vivo modelos experimentais de carcinoma hepatocelular (HCC) que recapitulam a doença humana fornecer uma plataforma valiosa para a pesquisa em fisiopatologia da doença e para a avaliação pré-clínica de novas terapias. Nós apresentamos uma variedade de métodos para gerar subcutânea ou ortotópicos xenoenxertos de carcinoma hepatocelular humano em ratinhos imunodeficientes que pode ser utilizado em uma variedade de aplicações de pesquisa. Com um foco sobre o uso de tecido do tumor primário de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica como ponto de partida, descrevemos a preparação de suspensões de células ou fragmentos tumorais para xeno. Descrevemos as técnicas específicas para estes tecidos de xenoenxerto i) por via subcutânea, ou ii) intrahepatically, quer por implantação directa de células tumorais ou fragmentos para o fígado, ou indirectamente através de injecção de células no baço do rato. Os requerentes também descrevem a utilização de ressecção parcial do fígado nativo do rato na altura do xeno-enxerto como uma estratégia parainduzir um estado de regeneração hepática ativa no rato destinatário que pode facilitar o enxerto intra-hepática de células tumorais humanas primárias. Os resultados esperados destas técnicas são ilustradas. Os protocolos descritos foram validados utilizando amostras HCC humanos primário e xenotransplantes, que normalmente executam menos robusta do que as linhas de células de carcinoma hepatocelular humano bem estabelecidas que são amplamente utilizados e freqüentemente citados na literatura. Em comparação com linhagens de células, discutimos os fatores que podem contribuir para a relativamente baixa chance de enxerto HCC primário em modelos de xenotransplante e comentar sobre as questões técnicas que podem influenciar a cinética de crescimento de xenotransplante. Sugerimos também os métodos que devem ser aplicados para garantir que xenografts obtidos assemelham-se com precisão os tecidos HCC-pai.

A Figura 3 demonstra a aparência típica de um xenoenxerto de carcinoma hepatocelular humano por via subcutânea e a aparência histopatológica correspondente do tumor. O desenvolvimento e o crescimento de xenoenxertos subcutâneos pode ser prontamente monitorizada por análise diária de ratos receptores. O intervalo de tempo entre xeno e desenvolvimento de um tumor pode variar muito, dependendo do tipo de tecido (fragmento do tumor vs suspensão de células), a fonte de tecido (amostra primária pac...

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Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

Tumores humanos transplantados em ratos imunodeficientes são ferramentas valiosas para o estudo da biologia do câncer. Protocolos específicos para gerar xenoenxertos subcutâneos e intra-hepáticos a partir de células de carcinoma hepatocelular humano ou fragmentos do tumor são descritos. A regeneração hepática induzida por hepatectomia parcial em ratos destinatário é apresentado como uma estratégia para facilitar o enxerto intra-hepática.

Geração de subcutânea e intra-hepática Humanos carcinoma hepatocelular Xenoenxertos em Immunodeficient Ratos

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

generation-subcutaneous-intrahepatic-human-hepatocellular-carcinoma

Research

JoVE Journal

Medicine

35.7K visualizações.  University Health Network.  Tumores humanos transplantados em ratos imunodeficientes são ferramentas valiosas para o estudo da biologia do câncer. Protocolos específicos para gerar xenoenxertos subcutâneos e intra-hepáticos a partir de células de carcinoma hepatocelular humano ou fragmentos do tumor são descritos. A regeneração hepática induzida por hepatectomia parcial em ratos destinatário é apresentado como uma estratégia para facilitar o enxerto intra-hepática. 

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Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

Transplante mamária de células estromais e células de carcinoma em camundongos C57BL/6J

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

Medicina

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Geração Experimental de Carcinoma Associado fibroblastos (FAC) de Fibroblastos Humanos mamária

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy and/or cytotoxic chemotherapy. To induce bladder cancer, C57BL/6 mice (MUC1.Tg and wild type) were treated orally with the carcinogen N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine (OH-BBN) at 3.0 mg/day, 5 days/week for 12 weeks. To assess the effects of OH-BBN on serum cytokine profile during tumor development, whole blood was collected via submandibular bleeds prior to treatment and every four weeks. In addition, a MUC1-targeted peptide vaccine and placebo were administered to groups of mice weekly for eight weeks. Multiplex fluorometric microbead immunoanalyses of serum cytokines during tumor development and following vaccination were performed. At termination, interferon gamma (IFN-&#947;)/interleukin-4 (IL-4) ELISpot analysis for MUC1 specific T-cell immune response and histopathological evaluations of tumor type and grade were performed. The results showed that: (1) the incidence of bladder cancer in both MUC1.Tg and wild type mice was 67%; (2) transitional cell carcinomas (TCC) developed at a 2:1 ratio compared to squamous cell carcinomas (SCC); (3) inflammatory cytokines increased with time during tumor development; and (4) administration of the peptide vaccine induces a Th1-polarized serum cytokine profile and a MUC1 specific T-cell response. All tumors in MUC1.Tg mice were positive for MUC1 expression, and half of all tumors in MUC1.Tg and wild type mice were invasive. In conclusion, using a team approach through the coordination of the efforts of pharmacologists, immunologists, pathologists and molecular biologists, we have developed an immune intact transgenic mouse model of bladder cancer that expresses hMUC1.

An N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced bladder cancer model was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic mice for the purpose of testing MUC1-directed immunotherapy. After administering a MUC1-targeted peptide vaccine, a cytotoxic T lymphocyte response to MUC1 was confirmed by measuring serum cytokine levels and T-cell specific activity.

Indução de carcinoma da bexiga invasivo de células transicionais em imunológico intacto Humanos MUC1 Ratos transgênicos: um modelo de desenvolvimento Imunoterapia

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

Criando anatomicamente precisos e reprodutíveis intracraniana Xenoenxertos de tumores cerebrais humanos

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

o<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick Corioalantóide membrana (CAM) como um Ensaio Xenoenxerto modelo eficiente de carcinoma hepatocelular

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of infection-induced immunopathology. Although Th17 cells are implicated in antifungal defense, their role in immunopathology is unclear. This study presents a method for establishing oral Th17 immunopathology associated with oral candidal infection in immunodeficient mice. The method is based on reconstituting lymphopenic mice with in vitro cultured Th17 cells, followed by oral infection with Candida albicans (C. albicans). Results show that unrestrained Th17 cells result in inflammation and pathology, and is associated with several measurable read-outs including weight loss, pro-inflammatory cytokine production, tongue histopathology and mortality, showing that this model may be valuable in studying OPC immunopathology. Adoptive transfer of regulatory cells (Tregs) controls and reduces the inflammatory response, showing that this model can be used to test new strategies to counteract oral inflammation. This model may also be applicable in studying oral Th17 immunopathology in general in the context of other oral diseases.

Although Candida infection models are available to study host immune resistance, a model to study T cell mediated immunopathology in the context of Candida infection is absent. Here we describe a method to establish Th17 immunopathology associated with oral Candida infection in immunodeficient mice.

Th17 Inflamação Modelo de orofaringe Candidíase em imunodeficientes Mice

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Singênico Rato Modelo de carcinoma hepatocelular Metástase

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals. This article introduces a standard protocol used to induce aortic aneurysms via subcutaneous infusion of angiotensin II (AngII) from implanted osmotic pumps. This protocol includes calculation of AngII amount and dissolution, osmotic pump filling, implantation of osmotic pumps subcutaneously, observation after pump implantation, and harvest of aortas to visualize aortic aneurysms in mice. Subcutaneous infusion of AngII through osmotic pumps following this protocol is a reliable and reproducible technique to induce both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice. Infusion durations range from a few days to several months based on the purpose of the study. AngII 1,000 ng/kg/min is sufficient to provide maximal effects on abdominal aortic aneurysmal formation in male hypercholesterolemic mouse models such as apolipoprotein E deficient or low-density lipoprotein receptor deficient mice. Incidence of abdominal aortic aneurysms induced by AngII infusion via osmotic pumps is 5 - 10 times lower in female hypercholesterolemic mice and also lower in both genders of normocholesterolemic mice. In contrast, AngII-induced thoracic aortic aneurysms in mice are not hypercholesterolemia or gender-dependent. Importantly, multiple features of this mouse model recapitulate those of human aortic aneurysms.

Subcutaneous implantation of osmotic pumps provides a convenient approach for prolonged and consistent delivery of compounds. This approach has been used extensively to study both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice.

Subcutânea perfusão de angiotensina II usando osmótica Bombas Induz aneurismas da aorta em ratos

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals.  This article introduces a standard protocol used to induce aortic ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depleção de células do rato de xenoenxertos de tumor humano Melhora Significativamente Análise Downstream de células alvo

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying the mechanisms of normal and malignant hematopoiesis and are the gold standard for identifying effective chemotherapies for many malignancies. PDX models are possible because many of the mouse cytokines also act on human cells. However, this is not the case for all cytokines, including many that are critical for studying normal and malignant hematopoiesis in human cells. Techniques that engineer mice to produce human cytokines (transgenic and knock-in models) require significant expense before the usefulness of the model has been demonstrated. Other techniques are labor intensive (injection of recombinant cytokine or lentivirus) and in some cases require high levels of technical expertise (hydrodynamic injection of DNA). This report describes a simple method for generating PDX mice that have exogenous human cytokine (TSLP, thymic stromal lymphopoietin) via weekly intraperitoneal injection of stroma that have been transduced to overexpress this cytokine. Use of this method provides an in vivo source of continuous cytokine production that achieves physiological levels of circulating human cytokine in the mouse. Plasma levels of human cytokine can be varied based on the number of stromal cells injected, and cytokine production can be initiated at any point in the experiment. This method also includes cytokine-negative control mice that are similarly produced, but through intraperitoneal injection of stroma transduced with a control vector. We have previously demonstrated that leukemia cells harvested from TSLP-expressing PDX, as compared to control PDX, exhibit a gene expression pattern more like the original patient sample. Together the cytokine-producing and cytokine-negative PDX mice produced by this method provide a model system that we have used successfully to study the role of TSLP in normal and malignant hematopoiesis.

Described here is a method for producing exogenous cytokine in patient-derived xenograft (PDX) mice via weekly intraperitoneal injection of a cytokine-transduced stromal cell line. This method broadens the utility of PDX and provides the option for transient or sustained exogenous cytokine delivery in a multitude of PDX models.

Expressão de citocina exógena em xenotransplantes derivados de pacientes via injeção com uma linha de células estromáticas transduzidas por citocinas

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying ...