A troca de regiões de proteínas estruturalmente semelhantes para criar kimeras nos permite investigar a importância das regiões responsáveis pelas funções biológicas da molécula a serem estudadas. As trocas de região antecedem a estrutura secundária geral da proteína para que a estrutura geral dessa região possa ser distinguida daquelas funções biológicas mediadas diretamente. Pode estar se transformando em selecionar quais regiões exatas devem ser substituídas.
Começar com trocas maiores geralmente é útil para identificar a funcionalidade-chave da proteína. Para iniciar o procedimento, selecione uma proteína adequada como doador para trocar regiões com a proteína de interesse conforme detalhado no protocolo de texto. Em seguida, obtenha as sequências de aminoácidos proteicos do receptor e proteínas doadoras do banco de dados de sequência de referência acessando primeiro a seção genética na página web do ref seq.
Digite o nome da proteína de interesse na caixa de pesquisa e clique em pesquisar. Clique no nome do gene para as espécies desejadas na lista resultante. Desça até a seção seq do ref para ver todas as isoformas documentadas.
Clique no identificador de sequência para a isoforme de interesse. Role para baixo e clique em cds para destacar a região de codificação de proteínas do gene. Na parte inferior direita da tela, clique no FAFSDA e copie a sequência genética.
Salve a sequência de DNA usando um software de edição de DNA adequado. Ao usar o APE disponível livremente, abra o programa, cole a sequência copiada na caixa em branco, selecione o nome da sequência e clique em salvar. Agora, escolha as regiões proteicas a serem substituídas nos diferentes construtos kiméricos, dividindo primeiro a sequência proteica de interesse em regiões estruturais distintas.
Para isso, baixe os dados estruturais da proteína de interesse do site da PDBe. Acesse a página PDBe para a proteína e baixe o arquivo PDBe clicando em baixar no lado direito da tela. Abra o arquivo PDBe em um sistema de visualização molecular, como Pymol.
Em Pymol, exiba a sequência de nucleotídeos, esconda os dados estruturais padrão e selecione a visão do desenho animado para visualizar claramente as características estruturais da proteína. Clique na sequência de nucleotídeos na parte superior da tela para destacar diferentes partes da molécula, observando os aminoácidos correspondentes a cada característica estrutural distinta. Agora, anote as distintas regiões estruturais na sequência de DNA em APE abrindo a sequência de DNA, selecionando-a e clicando em ORFs, em seguida, clique no último aminoácido da primeira região para destacar sua posição na sequência de DNA e selecionar a codificação do nucleotídeo para aquela região.
Clique com o botão direito do mouse na seleção e selecione novo recurso para dar-lhe um nome e uma cor. Repita o processo para cada região estrutural identificada na etapa anterior. Para alinhar as sequências de resíduos das duas proteínas, primeiro, obtenha as sequências completas de aminoácidos de proteínas doadoras e receptoras em APE.
Como antes, abra a sequência de DNA do doador, selecione-a e clique em ORFs traduzir. Em seguida, acesse a página da Ômega Clustal e, em seguida, coloque as sequências de aminoácidos das duas proteínas. Cada sequência deve ser procedida por uma linha de texto com nome de proteína a ser devidamente identificada.
Role para baixo e clique em enviar. Recupere o arquivo de alinhamento clicando na guia de arquivo de alinhamento de download e salve-o. Este arquivo pode ser aberto por qualquer programa de edição de texto.
Usando o arquivo de alinhamento como referência, anotar as regiões estruturais correspondentes da proteína doadora em sua sequência de DNA. Crie uma cópia da sequência de DNA anotada da proteína receptora e renomeie-a como uma proteína kimerica. Abra a sequência de DNA renomeada em APE.
Selecione a região a ser trocada na proteína doadora e selecione a região correspondente na proteína receptora renomeada. Cole a sequência de DNA de proteína doadora, e depois salve as mudanças. Projete os primers terminais usando um editor de DNA como a APE.
Crie um novo arquivo de DNA, inicie a cartilha final do terminal com uma sequência de líderes. Seguido pelo primeiro site de restrição selecionado nos vetores MCS e no espaçador opcional nos 18 a 27 pares base iniciais do gene de interesse. No novo arquivo de DNA, projete a sequência de primer do terminal C para começar com os pares finais de 18 a 27 pares base do gene de interesse seguido por um espaçador opcional, o segundo local de restrição escolhido e a sequência de líder.
Destaque toda a sequência, clique com o botão direito do mouse e selecione o elogio reverso para obter a cartilha reversa. Agora, projete primers para cada uma das regiões fronteiriças nas construções kimeric. Na sequência de DNA da kimera, destaque uma região de 30 pares de bases na zona onde as sequências originais e inseridas estão em contato.
Este é composto por 15 pares de base em cada sequência. Copie a região e cole-a em um novo arquivo de DNA. Esta sequência será a cartilha dianteira.
Faça uma cópia do primer dianteiro gerado na etapa anterior e renomeie-o como o primer reverso. Destaque a sequência de primer, clique com o botão direito do mouse e selecione o elogio reverso para gerar a sequência de primer reversa. Repita estas etapas para cada zona de contato na sequência de DNA kimérico.
Geralmente, dois conjuntos de primers invertidos dianteiros são necessários para gerar um kimera, a menos que a substituição ocorra nas regiões do terminal N ou terminal C. Prepare uma mistura individual de reação PCR para cada um dos fragmentos que compõem a proteína kimerica. Primeiro defina um tubo de microfuse de um ponto cinco mililiter no gelo e encorrea os diferentes reagentes das misturas PCR na ordem listada no protocolo de texto.
Certifique-se de que os primers e modelos corretos são empregados para cada reação pcr. Rotule dois finos dois tubos DE PCR de paredes finas para cada reação e transfira 20 microliters da mistura PCR correspondente em cada tubo. Transfira os tubos PCR para um termociclador PCR e inicie o protocolo conforme detalhado no protocolo de texto.
Depois que a reação do PCR for concluída, adicione quatro microliters de seis x tampão de carregamento de DNA em cada tubo. Insira o gel de 1% de agaross em uma unidade de eletroforese e cubra com tampão TAE. Carregue cuidadosamente as amostras no gel junto com um peso molecular.
Depois de executar o gel a 80 a 120 volts por 20 a 45 minutos, desligue a unidade de eletroforese e remova o gel agoross. Visualize as bandas de DNA amplificadas sob luz UV. Usando uma lâmina de barbear, corte os fragmentos de DNA individuais do gel e transfira-os para dois tubos de microfuse mililiter.
Depois de usar um kit de limpeza pcr para purificar os fragmentos de DNA, quantifique a quantidade de DNA recuperada medindo a absorção das amostras em 260 nanômetros e 340 nanômetros em um espectrômetro. Agora, realize a amplificação do PCR para gerar a sequência de DNA kimérico. Primeiro, configure 50 microliters de uma reação pcr para fundir os constituintes separados da kimera como antes.
Empregue os primers do terminal N e C, juntamente com 10 nanogramas de cada um dos fragmentos de DNA amplificados. Recuperar e quantificar o fragmento de DNA purificado como antes, em 30 microliters de água livre do núcleo. Este fragmento contém a sequência de DNA kimérico ladeada pelos locais de restrição incluídos nos primers do terminal.
A geração de uma proteína kimeric é exemplificada com dois membros da família Inter Luke e seis sytokine. Oncostaten M no fator inibidor da leucemia. O levantamento do OSM kimera resulta da troca da região do loop BC do OSM por uma sequência de elevação correspondente.
A primeira etapa de amplificação do PCR consistiu em três reações separadas. O fragmento OSM do terminal N, que exigia os osm de terminal N e primers invertidos bc usou OSM como modelo. O loop LIF BC foi obtido através do bc start forward e bc n primers reversos usando LIF como modelo.
O fragmento osm do terminal C utilizou primers reversos DOM final e C do terminal C, bem como os OSM como modelo. Esses fragmentos purificados foram então usados como modelo na segunda reação pcr, juntamente com os primers inversos OSM do terminal N e C-terminal para amplificar a sequência de genes de loop OSM LIF BC correspondente. Após a purificação e transformação em e-coli, os plasmídeos individuais foram isolados e rastreados pela digestão enzimápica de restrição para a inserção adequada do fragmento de DNA.
A eletroforese gel revelou acertos positivos que foram enviados para verificação de sequência. Proteínas kimericas devem ser produzidas e a atividade medida em um perfeito sistema de facção. A fim de determinar a importância das regiões substituídas para essa facção em particular.
Esta técnica tem sido muito útil e frequentemente aplicada, interferiu de receptores sinalizados a fim de identificar domínios de funções-chave e locais de reconhecimento de receptores. O número que uso para eletroforese de DNA deve ser manipulado usando luvas descartáveis, um casaco de laboratório e óculos de proteção.
