Os autores desejam reconhecer o apoio da Fundação Rioja Salud (Fondos FEDER) e do Ministro espanhol de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00). Cristina Romero Aranda é financiada por uma bolsa da AECC (Asociación Española Contra el Cáncer).

1. Cresça C. elegans em pratos de Petri
<ol><li>Prepare as placas de NGM e as semee com E. coli OP50 como fonte de alimento (Figura 1). Cresça e mantenha C. elegans como descrito17. Armazene as placas semeadas a 4 °C por até um mês.</li>
	<li>Ajuste as placas à temperatura desejada antes de adicionar os vermes.<ol>
<li>Para transferir os vermes, remova um pedaço de ágar de uma placa velha e coloque-o em um prato fresco.</li>
		<li>Alternativamente, capture animais solteiros com um catador de vermes estéril (um pedaço de 1 polegada de fio de platina de calibre 32 com uma ponta achatada, montado na ponta de uma pipeta Pasteur) e coloque-os na nova placa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cresça os vermes na temperatura desejada.<ol>
<li>Cresça C. elegans vermes a 20 °C, a temperatura padrão. No entanto, para analisar o desenvolvimento de mutantes termosensíveis, realize uma incubação durante a noite, geralmente a 25 °C. Ajuste a duração e a temperatura desta incubação conforme necessário, dependendo do mutante específico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Prepare a gravação da microscopia 4D antes de montar os embriões (Figura 2)
<ol><li>Configure o microscópio e os controles de temperatura antes de preparar o embrião. C. elegans embriões se dividem muito rapidamente. Prepare-se para começar a gravar imediatamente após a montagem dos embriões.</li>
	<li>Ajuste a temperatura de gravação para 15 °C, 20 °C ou 25 °C.<ol>
<li>Regissão rotineiramente os embriões a 25 °C. Registre mutantes termo-sensíveis na temperatura restritiva para mostrar seus fenótipos. Registo um controle WT (se feito em uma preparação diferente) na mesma temperatura que os mutantes. NOTA: Os embriões WT desenvolvem-se mais rápido a 25 °C e mais lento a 15 °C sem diferenças adicionais na linhagem celular. Coloque microscópios em uma sala controlada pela temperatura. Controle adicional por resfriamento ou aquecimento do slide é altamente desejável. Isso pode ser alcançado através da água circulante a uma temperatura específica através de um anel de metal em torno do objetivo do microscópio e do condensador. O objetivo e a preparação estão em contato direto através do óleo de imersão e a transferência de temperatura é eficiente. Este sistema permite um controle preciso da temperatura de gravação e para a realização de mudanças de temperatura durante o desenvolvimento de embriões.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Defina os parâmetros de registro no software de microscopia.<ol>
<li>Para uma gravação padrão de C. elegans (sem varreduras fluorescentes), selecione: z-stacks de 30 planos focais, a uma distância de 1 mícdo cada. Intervalos de 30 segundos entre o início de cada pilha z. 1500 z-stacks (12,5 horas de registro). NOTA: Tanto os programas de controle de microscópio de código aberto quanto comercial podem ser usados para definir este fluxo de trabalho para capturar imagens. Agora o microscópio está pronto para gravar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Prepare e monte os embriões
<ol><li>Prepare uma almofada de ágar fina e homogênea como o primeiro passo para obter uma imagem agradável (Figura 3).<ol>
<li>Prepare 50 ml de uma solução de 4,5% de ágar em água deionizada. Aqueça para ferver no micro-ondas e despeje 0,5 – 1 ml em tubos de vidro de 3 ml.</li>
		<li>Sele cuidadosamente os tubos com filme de cera para evitar a proficação. Os tubos de ágar selados podem ser armazenados à temperatura ambiente por até dois meses.</li>
		<li>No banco do laboratório, tenha um bloco de calor a 80 °C com: um tubo de ensaio de geleia de petróleo puro (derretido), com um pincel fino dentro. um tubo de ensaio com água destilada contendo uma pipeta Pasteur. NOTA: Isso garante que todos os materiais necessários estarão quentes, e o ágar não se solidificará no processo de fabricação do bloco.</li>
		<li>Remova o filme de cera do topo de um dos tubos de ágar, e aqueça-o cuidadosamente sobre um queimador de álcool para derreter o ágar. Tenha cuidado, pois o ágar quente expelido do tubo de vidro pode causar queimaduras.</li>
		<li>Uma vez que o ágar esteja derretido, coloque o tubo no bloco de calor para manter o ágar em forma líquida.</li>
		<li>Alternativamente, coloque os tubos de ágar no bloco de calor 1h antes do experimento para derretê-los sem usar um queimador. O ágar derretido deve ser descartado depois de um dia.</li>
		<li>Coloque um slide de microscópio (Slide A) entre outros dois em um pedaço de plástico.</li>
		<li>Pegue outro slide (Slide B) e segure-o com os dedos em uma mão.</li>
		<li>Por outro lado, coloque uma pequena gota de ágar derretido no centro do Slide A usando a pipeta pasteur quente.</li>
		<li>Pressione imediatamente o slide B na gota de ágar para criar uma almofada muito fina entre slides A e B. Mantenha estes slides espremidos até o passo 3.2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monte os embriões.<ol>
<li>Colete 5-10 hermafroditas gravid com o catador e coloque-os em um copo de relojoeiro cheio de água.</li>
		<li>Use um bisturi para cortar os nematoides hermafroditas e extrair ovos precoces (1-4 células) do útero, sob o estereoscópio.</li>
		<li>Pegue o slide da etapa 3.1.10 e deslize suavemente o Slide B para expor a almofada de ágar no Slide A.</li>
		<li>Coloque um ovo no centro da almofada de ágar por pipetar com um tubo capilar.</li>
		<li>Alternativamente, pipeta uma gota contendo um conjunto de embriões na almofada de ágar e, em seguida, procurar embriões em estágio inicial. Faça este passo sob o estereótipo.</li>
		<li>Se necessário, mova o ovo cutucando-o com um cílio colado no final de um palito.</li>
		<li>Remova o excesso de água com a pipeta capilar. NOTA: Uma pipeta capilar pode ser facilmente preparada aquecendo uma pipeta Pasteur sobre um queimador de álcool e puxando-a de ambas as extremidades.</li>
		<li>Cubra cuidadosamente a preparação com um deslizamento de cobertura. Para evitar bolhas de ar, coloque uma borda da mancha de cobertura no slide e deslize suavemente um bisturi ao longo da borda adjacente para lentamente e obliquamente cobrir o deslizamento de tampas na preparação.</li>
		<li>Use uma pipeta para encher 3/4 do espaço ao redor da almofada de ágar com água. Deixe 1/4 do espaço com ar.</li>
		<li>Sele o deslizamento com geleia de petróleo para evitar a dessecação durante longos períodos de gravação.</li>
		<li>Use a escova fina para estender uma fina camada de geleia de petróleo derretida ao redor da borda da tampa. NOTA: Agora a preparação está pronta para gravação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Ajuste o DIC e inicie a gravação de microscopia 4D
<ol><li>Coloque o slide no estágio do microscópio. Concentre o embrião utilizando o objetivo de baixa ampliação (5x ou 10x).</li>
	<li>Mude para o objetivo de imersão de 100x.</li>
	<li>Ajuste os componentes ópticos do microscópio para obter uma imagem Nomarski.<ol>
<li>Concentre o condensador.</li>
		<li>Abra completamente a abertura do condensador e feche o diafragma de campo (isso proporcionará uma maior abertura numérica e, portanto, maior resolução).</li>
		<li>Verifique se ambos os polarizadores no microscópio são orientados para causar a máxima extinção da luz.</li>
		<li>Gire o prisma wollaston para obter uma bela imagem tridimensional do embrião, iluminado de um lado. Gire o prisma na outra direção para obter o efeito de ter o embrião iluminado do outro lado. NOTA: Estas etapas podem ser realizadas em uma amostra de ensaio antes da gravação, de modo que apenas um ajuste fino seja necessário na amostra que está sendo analisada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inicie a captura de imagem no microscópio.</li>
</ol>5. Analise o filme 4D (Figura 4).
NOTA: Uma vez que a gravação esteja concluída, use o software de rastreamento de linhagem celular para reconstruir e analisar a linhagem celular.
O software de rastreamento de linhagem celular é uma ferramenta poderosa para realizar análises detalhadas do desenvolvimento embrionário ou dinâmica em culturas celulares ou fragmentos de tecido. O programa extrai e quantifica vários conjuntos de dados sobre a dinâmica celular da amostra que incluem a geração da linhagem celular completa de cada célula registrada, incluindo divisões celulares, comprimento do ciclo celular, migração ou apoptose, bem como sua cinética. Além disso, a diferenciação celular pode ser pontuada pelas alterações morfológicas da célula ou pela expressão de marcadores específicos. Basicamente, a tela de software exibe duas janelas: na janela esquerda, o filme 4D pode ser reproduzido para frente e para trás ou para cima e para baixo para os níveis superior ou inferior para que cada célula possa ser seguida no tempo e no espaço durante toda a gravação. Na viúva direita, a linhagem celular é gerada. Clicar em um núcleo celular no filme 4D gera um ponto na janela de linhagem que armazena as informações do nome celular, destino e coordenadas espaciais. A linhagem celular de uma célula específica é gerada reproduzindo o filme 4D para a frente e clicando periodicamente no núcleo para marcar a mitose dessa célula específica ao longo do tempo. A repetição desse processo para cada uma das células registradas gera a linhagem celular completa do embrião ou amostra. As informações armazenadas para coordenadas espaciais de cada célula são posteriormente usadas para reconstruir modelos de embriões 3D e caminhos de migração celular.
<ol><li>Abra o software de rastreamento de linhagem e crie um novo projeto indo para o menu da barra superior e selecionando: | de arquivos Novo projeto.</li>
	<li>Selecione o modelo de linhagem celular dependendo da temperatura de gravação: DB08 para gravação a 25 °C, DB10 para gravação a 20 °C e DB12 para gravação a 15 °C.</li>
	<li>Defina os parâmetros de gravação na janela emergente: contagem de varredura (geralmente 1500), tempo entre as varreduras (30 segundos), contagem de nível (30) e distância entre os níveis (1 míccro).</li>
	<li>Selecione o arquivo de imagem e o formato.<ol>
<li>Selecione o diretório de imagens onde as imagens foram salvas.</li>
		<li>Escolha se as imagens devem ser salvas como imagens únicas (uma imagem por nível e tempo) ou como pilhas z de várias imagens.</li>
		<li>Determine a nomeação do arquivo e o formato de imagem. Rotineiramente, imagens únicas são salvas sob os seguintes nomes: X0000L00C1 (para varredura 0, nível 0, canal 1) X0000L01C1 (para varredura 0, nível 1, canal 1) X0000L02C1 (para digitalização 0, nível 2, canal 1) ... X0001L00C1 (para varredura 1, nível 0, canal 1) X0001L01C1 (para varredura 1, nível 1, canal 1) ... X0300L04C1 (para digitalização 300, nível 4, canal 1) ... NOTA: Salvar as imagens em um formato compactado economiza espaço no disco rígido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Defina os canais de luz: 1 para óptica DIC, 2 para GFP, 3 para RFP, etc. Adicione aqueles que foram usados na gravação 4D. Clique em "processamento de canal ativado" para detectá-los.</li>
	<li>Comece a traçar a linhagem celular do embrião. A tela agora contém duas janelas principais: a janela de vídeo e a janela de linhagem celular.<ol>
<li>Na janela de linhagem, selecione um ramo de linhagem e use o mouse para clicar no núcleo celular correspondente a esta célula na janela de vídeo.</li>
		<li>Siga a célula espacialmente e ao longo do tempo reproduzindo o filme 4D para frente, para trás ou para cima ou para baixo em um nível, usando as teclas do cursor.</li>
		<li>Clique periodicamente no núcleo celular. Isso gera um ponto no ramo de linhagem e registra as coordenadas espaciais da célula neste momento. Como resultado, a linhagem celular progride, e reconstruções 3D do embrião são possíveis.</li>
		<li>Marque mitose clicando na tecla de retorno. Em seguida, selecione uma das células da filha e siga-a como antes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita o processo (etapas 5.6.1 a 5.6.4) para que o resto das células embrionárias rastreiem a linhagem celular completa, ou siga células específicas de interesse, como as submetidas à apoptose.</li>
	<li>Compare a linhagem mutante com a linhagem celular wt c. elegans estereotipada.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).</li><li>Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. 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M., Almendinger, J., Cabello, J., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Acetylcholine+Signaling+Reduces+Cell+Clearance+Deficiencies+in+Caenorhabditis+elegans.">Loss of Acetylcholine Signaling Reduces Cell Clearance Deficiencies in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS One. 11 (2), 0149274 (2016).</li><li>S&#225;enz-Narciso, B., G&#243;mez-Orte, E., Zheleva, A., Gastaca, I., Cabello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+developmental+networks+by+Rac/Rho+small+GTPases:+How+cytoskeletal+changes+during+embryogenesis+are+orchestrated.">Control of developmental networks by Rac/Rho small GTPases: How cytoskeletal changes during embryogenesis are orchestrated.</a> Bioessays. 38 (12), 1246-1254 (2016).</li><li>Zheleva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+mRNA+export+unmasks+different+tissue+sensitivities+to+low+mRNA+levels+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Reduction of mRNA export unmasks different tissue sensitivities to low mRNA levels during Caenorhabditis elegans development.</a> PLOS Genetics. 15 (9), 1008338 (2019).</li><li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope:+variability+of+development+and+regional+specification.">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Developmental Biology. 184 (2), 234-265 (1997).</li><li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+C.+elegans+Embryos+using+an+Epifluorescent+Microscope+and+Open+Source+Software.">Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2625 (2011).</li><li>Boyd, L., Hajjar, C., O'Connell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Microscopy+of+Early+Embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2852 (2011).</li><li>Urbach, R., Schnabel, R., Technau, G. 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E., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+embryonic-abembryonic+axis+of+the+mouse+blastocyst:+relationships+between+orientation+of+early+cleavage+divisions+and+pattern+of+symmetric/asymmetric+divisions.">Formation of the embryonic-abembryonic axis of the mouse blastocyst: relationships between orientation of early cleavage divisions and pattern of symmetric/asymmetric divisions.</a> Development. 135 (5), 953-962 (2008).</li><li>Mora-Lorca, J. 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Os autores não têm nada a revelar.

Um dos grandes desafios da biologia moderna é entender o desenvolvimento de organismos multicelulares. C. elegans emergiu como um dos modelos mais adequados para estudar a coordenação fina entre a proliferação celular e a diferenciação celular no embrião em desenvolvimento. Do ponto de vista óptico, seu corpo transparente e seu pequeno tamanho fazem deste nematode um espécime ideal para microscopia DIC. Outros organismos com características semelhantes também foram submetidos à análise de microscopia 4D 11,12,13,14,15,16.
Para esses estudos de desenvolvimento, a inativação genética genética por frente ou reversa fornece uma pista de seu envolvimento em embriogênese. Uma vez provado que um gene desempenha um papel no desenvolvimento, o próximo passo é definir seu papel exato no estabelecimento do plano corporal correto. Imunostaining é a abordagem selecionada para a maioria dos modelos. Esta técnica elucida problemas na diferenciação celular ou expressão de marcadores específicos. No entanto, uma grande limitação dessa abordagem é que ela só fornece uma visão estática da expressão de um único ou mais marcadores em um ponto fixo de desenvolvimento. Uma visão dinâmica desses marcadores durante todo o desenvolvimento só pode ser obtida colorindo diferentes embriões em diferentes pontos de tempo. Além disso, a reconstrução da linhagem celular não é possível em amostras tão fixas.
A microscopia 4D é uma abordagem complementar para o estudo do desenvolvimento embrionário. Essa técnica revela a dinâmica de desenvolvimento em uma resolução de nível celular. Qualquer defeito no embrião, como problemas na orientação do fuso, migração celular, apoptose, especificação do destino celular, etc. aparecerá em um filme 4D que pode ser visualizado para frente e para trás, quantificado e pontuado pelo pesquisador. Usando essa técnica, praticamente todas as células do embrião podem ser acompanhadas até o momento em que o embrião começa a se mover. Embriões submetidos à microscopia 4D apenas com luz visível e óptica Nomarski não incorrem em fotodamagem. As varreduras fluorescentes também podem ser intercaladas dentro da gravação para detectar quando e onde um gene é expresso. Embriões que sofrem fotodamagem significativa são identificados pela extensão do ciclo celular que causa forte irradiação UV em comparação com um embrião de linhagem padrão WT. Nesse caso, a fotodamagem pode ser reduzida reduzindo a intensidade da lâmpada UV e aumentando a sensibilidade da câmera ou o tempo de exposição. Características morfológicas e marcadores moleculares podem ajudar a esclarecer o desenvolvimento embrionário de qualquer mutante.
A criação de um sistema de microscopia 4D é fácil de implementar em laboratório e, após alguma prática, permite uma análise incomparável da dinâmica celular e rastreamento de linhagem de culturas celulares e espécimes transparentes vivos a um nível de resolução de cada célula no campo do microscópio. O rastreamento de linhagem celular em imagens DIC ainda é processado manualmente. É demorado e, embora o software detecte erros de linhagem, como diferentes ramos de linhagem marcando a mesma célula, erros são possíveis. Embora a detecção automática de células rotuladas por GFP seja bem desenvolvida2, o software de rastreamento de linhagem complementar baseado em células não marcadas e imagens de luz visível ainda está em estágio inicial e não é realmente útil para uma análise completa de embriões. Sem dúvida, a aplicação de sistemas de reconhecimento de imagem para o campo da microscopia de luz visível trará um grande avanço neste campo.

A microscopia 4D é um sistema de gravação de lapso de tempo multifocal que permite aos pesquisadores registrar e quantificar a dinâmica celular de uma amostra biológica espacialmente e ao longo do tempo. Culturas celulares, leveduras ou tecidos vivos podem ser submetidos à análise 4D, mas essa técnica é especialmente adequada para analisar o desenvolvimento de embriões vivos. A resolução desta análise atinge o nível de cada célula do embrião. Cada divisão celular pode ser detectada, e movimentos celulares podem ser rastreados ao longo do tempo. Os destinos celulares são avaliados de acordo com a posição e forma que as células adquirem. O uso da óptica Nomarski aumenta o contraste de amostras transparentes não manchadas usando feixes de luz hitogonalmente polarizados que interferem no plano focal. As imagens resultantes aparecem tridimensionais, iluminadas de um lado.
Outros métodos baseados no uso de microscopia confocal e animais transgênicos GFP para detecção automática de núcleos e geração de linhagens celulares foram desenvolvidos 1,2. A vantagem desses sistemas é óbvia: o software substitui muito a necessidade de marcar manualmente cada núcleo durante um período de tempo (embora alguma supervisão manual seja necessária durante os estágios finais). No entanto, os processos celulares envolvendo mudanças na forma celular ou dinâmica da membrana, como os que ocorrem durante a diferenciação celular, migração, apoptose ou engolfação de cadáver, permanecem escondidos como um fundo preto nas imagens de núcleos fluorescentes.
Em contraste, a microscopia 4D Nomarski (também chamada microscopia DIC, microscopia de contraste de interferência diferencial) mostra alterações nos núcleos e na forma celular que ocorrem durante o desenvolvimento de animais selvagens ou mutantes. Isso permite o rastreamento de linhagem celular usando microscópios padrão, empregando apenas luz transmitida. Não há necessidade geral de usar animais transgênicos, exceto para mostrar padrões de expressão específicos, nesse caso os exames fluorescentes podem ser intercalados. Portanto, essa pode ser a abordagem ideal para muitos laboratórios que trabalham em processos celulares dinâmicos, como embriogênese ou apoptose, que podem ser destacados sob microscopia DIC 3,4,5,6,7.
Vários programas flexíveis e fáceis de usar estão disponíveis para capturar imagens microscópicas e reconstruir linhagens celulares, modelos 3D, caminhos de migração celular, etc. na amostra gravada. Em um experimento padrão, as imagens são adquiridas em uma série de planos focais, a uma distância constante, o número que depende da espessura da amostra. A resolução temporal da análise pode ser otimizada aumentando a frequência de varredura. Não há praticamente nenhum limite para a duração da gravação além da capacidade de armazenamento do computador. Por exemplo, para uma análise de desenvolvimento de embriões C. elegans , nós rotineiramente adquirimos imagens em 30 planos focais (1 micron-passo cada), a cada 30 segundos durante 12 horas.
Esses sistemas foram aplicados à análise de vários embriões animais, como Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster11, outros embriões de nematoides 12,13, tardigrades14,15 e até mesmo embriões de camundongosprecoces 16. O único requisito é ter um embrião transparente capaz de desenvolver na preparação do slide sob o microscópio.
Em resumo, a microscopia 4D baseada em DIC é especialmente útil para 1) analisando o desenvolvimento embrionário de animais pequenos e transparentes: traçando a linhagem celular, caminhos de migração celular, geração de modelos 3D, etc; 2) definição de padrões de expressão genética; 3) estudar a dinâmica da cultura celular, da levedura às células humanas; 4) análise da dinâmica tecidual ou fragmentos de embriões; 5) quantificar cinética de morte celular e engolfação de cadáver; e 6) realização de análise filogenia comparativa com base em características embrionárias de desenvolvimento. Se houver interesse em qualquer um desses tópicos (ou similares), a microscopia 4D pode ser usada.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans (N2)&lt;/em&gt;</td><td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td><td>N2</td><td>WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans (VZ454)&lt;/em&gt;</td><td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td><td>VZ454</td><td>gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Cell Lineage Tracing software</td><td>SIMI</td><td>Simi BioCell</td><td>This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html</td></tr><tr><td>Microscope camera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-R2</td><td>Miscroscope camera for both transmitted and UV light</td></tr><tr><td>Microscope control software</td><td>Caenotec</td><td>Time to Live</td><td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel&lt;br/&gt; Kleine Dorfstr. 9 38312 B&amp;ouml;r&amp;szlig;um, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de</td></tr><tr><td>Microscope control software</td><td>Micro-manager</td><td>Micro-manager</td><td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>Motorized microscope</td><td>Leica</td><td>Leica DM6000</td><td>Motorized upright microscope to perform 4D microscopy</td></tr><tr><td>Standard equipment in a Molecular Biology lab.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td>Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos.</td></tr></tbody></table>

4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy

A microscopia 4D é uma ferramenta inestimável para desvendar o processo de desenvolvimento embrionário em diferentes animais. Nas últimas décadas, caenorhabditis elegans emergiu como um dos melhores modelos para estudar o desenvolvimento. Do ponto de vista óptico, seu tamanho e corpo transparente fazem deste nematode um espécime ideal para microscopia DIC (Diferencial Interference Contrast ou Nomarski). Este artigo ilustra um protocolo para o cultivo de nematoides C. elegans , preparando e montando seus embriões, realizando microscopia 4D e rastreamento de linhagem celular. O método é baseado em registros multifocais de imagens e análises de nomarski com software específico. Esta técnica revela dinâmica de desenvolvimento embrionário no nível celular. Qualquer defeito embrionário em mutantes, como problemas na orientação do fuso, migração celular, apoptose ou especificação do destino celular, pode ser detectado e pontuado de forma eficiente. Praticamente todas as células do embrião podem ser seguidas até o momento em que o embrião começa a se mover. Traçar a linhagem celular completa de um embrião C. elegans por microscopia DIC 4D é trabalhoso, mas o uso de software específico facilita muito essa tarefa. Além disso, essa técnica é fácil de implementar em laboratório. A microscopia 4D é uma ferramenta versátil e abre a possibilidade de realizar uma análise incomparável do desenvolvimento embrionário.

Para caracterizar o desenvolvimento embrionário de um mutante C. elegans para o gene gsr-1, que codifica a enzima glutathione reductase, necessária para regenerar glutationa reduzida (GSH) e envolvida na manutenção da homeostase redox no nematode, realizamos microscopia 4D de um mutante de exclusão gsr-1 (tm3574) que é uma perda de função allele causando um fenótipo de parada embrionária precoce18. Tanto wt quanto gsr-1 (tm3574) mutantes C. elegans nematodes foram cultivados em placas NGM semeadas com E. coli OP50 como a fonte de alimento17. os vermes gsr-1 (tm3574) foram cultivados como heterozigos a 20 °C por duas gerações e, em seguida, os vermes homozigos (que são capazes de crescer até a idade adulta graças à carga materna) foram deslocados para 25 °C para uma incubação durante a noite antes da análise de embriões. Placas de vermes foram incubadas dentro de caixas de papelão para evitar condensação (Figura 1). Nematoides gravid foram abertos para extrair embriões jovens.
Para comparar o desenvolvimento embrionário do mutante versus o estereotipado WT em condições idênticas, um WT (como controle) e um embrião gsr-1 (tm3574) foram colocados na mesma preparação um ao lado do outro. O fluxo de trabalho de microscopia 4D foi executado em um microscópio de ereta motorizado padrão equipado com óptica DIC. Os parâmetros de gravação selecionados no programa de controle de microscópio foram: pilhas z de 30 planos focais a 1 micron de distância cada, intervalos de 30 segundos entre o início de cada pilha z e 1500 z-stacks (12,5 horas de gravação). A temperatura de gravação foi ajustada para 25 °C (tanto na sala quanto no estágio do microscópio) (Figura 2).
Uma vez que a gravação foi concluída, o arquivo de imagens foi aberto, e a linhagem celular foi reconstruída usando software de rastreamento de linhagem clicando em núcleos celulares mostrados na janela de vídeo (Figura 4). A linhagem celular mutante gsr-1 (tm3574) foi comparada com a linhagem C. elegans WT retratada no fundo. Um resultado importante foi a detecção de um atraso progressivo do ciclo celular durante o desenvolvimento embrionário. Como consequência, embriões mutantes presos em estágios intermediários, enquanto os embriões WT progrediram e finalmente eclodiram como larvas.
A preparação e a observação direta de embriões sob o microscópio ou imunostaining com anticorpos contra marcadores embrionários tardios poderiam revelar a presença de uma alta porcentagem de embriões jovens no mutante em comparação com a prisão de embriões WT. poderia então ser inferida como a explicação mais plausível. No entanto, a prova direta e a quantificação exata do atraso do ciclo celular só podem ser mostradas de forma elegante e fácil e quantificadas através de um experimento de microscopia 4D. Outras características importantes do desenvolvimento embrionário, como diferenciação celular ou apoptose (Figura 5) também podem ser visualizadas de forma dinâmica usando microscopia 4D que oferece uma análise detalhada de múltiplos aspectos do desenvolvimento em um único experimento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig01.jpg"> Figura 1: C. elegans nematoides crescendo em condições laboratoriais. Os nematoides são cultivados em placas de GNM semeadas por E. coli, armazenados em caixas de papelão e incubados a 15 °C, 20 °C ou 25 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig02.jpg"> Figura 2: Captura de tela do software de gravação de microscopia 4D. Exemplo de dois programas de software de controle de microscópio diferentes (A e B). Esses programas criam fluxos de trabalho para controlar o microscópio e a captura de imagens durante a gravação de microscopia 4D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig03.jpg"> Figura 3: Fotografias em série da preparação do ágar pad e montagem do embrião C. elegans . A. Tubos de ágar preparados. B-C. Preparação do ágar pad. D. Deslize parcialmente cheio de água. E. Selar o escorregador com geleia de petróleo. F. Preparação final. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig04.jpg"> Figura 4: Capturas de tela serial do software rastreador de linhagem celular. O programa permite a reconstrução da linhagem celular embrionária de um mutante de atraso de ciclo celular (esquerda) e um embrião WT (direita) C. elegans . Um. Um passo inicial do desenvolvimento. B-C. O desenvolvimento de ambos os embriões progride ao longo do tempo. O embrião D. WT desenvolve-se adequadamente e inicia o alongamento enquanto o mutante prende. Em todos os casos, o programa exibe a janela de vídeo e a janela de linhagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig05v2.jpg"> Figura 5: Forma refrátil de lentilha de células apoptóticas em um embrião C. elegans WT. O destino celular, definido por características morfológicas, pode ser avaliado por microscopia 4D. A imagem mostra um embrião C. elegans no estágio do feijão. As células vivas mostram núcleos de forma lisa cercados por um citoplasma granular. Em contraste, as células apoptóticas (setas amarelas) condensam e adotam uma forma refrátil semelhante à lentilha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar e montar embriões de Caenorhabditis elegans , registrando o desenvolvimento sob um microscópio 4D e traçando a linhagem celular.

Microscopia 4D: Desvendando caenorhabditis elegans Desenvolvimento Embrionário usando Microscopia Nomarski

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

4d-microscopy-unraveling-caenorhabditis-elegans-embryonic-development

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

2.5K visualizações.  CIBIR (Center for Biomedical Research of La Rioja), La Rioja, Spain. Aqui, apresentamos um protocolo para preparar e montar embriões de Caenorhabditis elegans , registrando o desenvolvimento sob um microscópio 4D e traçando a linhagem celular.

Vídeo: 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, acceleration and forces involved in the locomotory behavior of nematodes suspended in a column of water in response to single wavelengths of light. We demonstrate how to evaluate the locomotion of a microscopic organism using Single Wavelength Shadow Imaging (SWSI) using two different examples.
The first example is a systematic and statistically viable study of the average descent of C. elegans in a column of water. For this study, we used living and dead wildtype C. elegans. When we compared the velocity and direction of nematode active movement with the passive descent of dead worms within the gravitational field, this study showed no difference in descent-times. The average descent was 1.5 mm/sec &#177; 0.1 mm/sec for both the live and dead worms using 633 nm coherent light.
The second example is a case study of select individual C. elegans changing direction during the descent in a vertical water column. Acceleration and force are analyzed in this example. This case study demonstrates the scope of other physical properties that can be evaluated using SWSI while evaluating the behavior using single wavelengths in an environment that is not accessible with traditional microscopes. Using this analysis we estimated an individual nematode is capable of thrusting with a force in excess of 28 nN.
Our findings indicate that living nematodes exert 28 nN when turning, or moving against the gravitational field. The findings further suggest that nematodes passively descend in a column of water, but can actively resist the force of gravity primarily by turning direction.

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

The technique presented here measures the path of freely swimming microscopic species using single wavelength exposure. C. elegans are used to demonstrate shadow imaging as an inexpensive alternative to costly microscopes. This technique can be adapted to accommodate various orientations, environments and species to measure direction, speed, acceleration and forces.

Comprimento de Onda Único Sombra Imagem de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Locomotion incluindo a força Estimativas

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Engenharia

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column inside an optical cuvette. A 632 nm continuous wave HeNe laser is directed through the cuvette using front surface mirrors. A significant distance of at least 20-30 cm traveled after the light passes through the cuvette ensures a useful far-field (Fraunhofer) diffraction pattern. The diffraction pattern changes in real time as the nematode swims within the laser beam. The photodiode is placed off-center in the diffraction pattern. The voltage signal from the photodiode is observed in real time and recorded using a digital oscilloscope. This process is repeated for 139 wild type and 108 &#34;roller&#34; C. elegans. Wild type worms exhibit a rapid oscillation pattern in solution. The &#34;roller&#34; worms have a mutation in a key component of the cuticle that interferes with smooth locomotion. Time intervals that are not free of saturation and inactivity are discarded. It is practical to divide each average by its maximum to compare relative intensities. The signal for each worm is Fourier transformed so that the frequency pattern for each worm emerges. The signal for each type of worm is averaged. The averaged Fourier spectra for the wild type and the &#34;roller&#34; C. elegans are distinctly different and reveal that the dynamic worm shapes of the two different worm strains can be distinguished using Fourier analysis. The Fourier spectra of each worm strain match an approximate model using two different binary worm shapes that correspond to locomotory moments. The envelope of the averaged frequency distribution for actual and modeled worms confirms the model matches the data. This method can serve as a baseline for Fourier analysis for many microscopic species, as every microorganism will have its unique Fourier spectrum.

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to distinguish different nematodes using far-field diffraction signatures. We compare the locomotion of 139 wild type and 108 &#34;Roller&#34; C. elegans by averaging frequencies associated with the temporal Fraunhofer diffraction signature at a single location using a continuous wave laser.

Fourier-com base em análise de difração de viver Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Microscopia de folha de luz isotrópica e análise de linhagem de células automatizadas para catalogar Caenorhabditis elegans Embryogenesis com resolução subcelular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Biologia do Desenvolvimento

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualizando neuroblasto Cytokinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogênese

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Neurociência

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Novas métricas para Caracterizar Embryonic Alongamento do nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biologia

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

Uso de Microscopia Time Lapse para Visualize Anoxia induzida Suspended Animation em<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriões

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Microscopia 4D: Desvendando caenorhabditis elegans Desenvolvimento Embrionário usando Microscopia Nomarski

Resumo

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Comprimento de Onda Único Sombra Imagem de

Fourier-com base em análise de difração de viver Caenorhabditis elegans

Microscopia de folha de luz isotrópica e análise de linhagem de células automatizadas para catalogar Caenorhabditis elegans Embryogenesis com resolução subcelular

Visualizando neuroblasto Cytokinesis Durante

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

Novas métricas para Caracterizar Embryonic Alongamento do nemátodo

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Básico

Uso de Microscopia Time Lapse para Visualize Anoxia induzida Suspended Animation em