Este protocolo é baseado em técnicas aprendidas no laboratório de Francis-André Wollman na França Institut de Biologie Physico-Chimique, Paris,. Os autores têm uma dívida de gratidão para com Jacqueline Girard-Bascou, que originalmente introduzido DBS para Chlamydomonas técnicas genéticas. Chlamydomonas pesquisa no laboratório dos autores é suportado pelo National Science Foundation prêmio MCB-0646350.

Parte 1: Preparação de cepas de gametogênese Nota: Todas as manipulações devem ser realizadas à temperatura ambiente. Temperaturas superiores ou inferiores irá afetar a velocidade de germinação zigoto e pode afetar adversamente a viabilidade. Consideração importante: é essencial que as cepas de ser acoplado estão crescendo robustamente e estão livres de contaminação de fungos ou bactérias. Se as cepas não foram transferidos regularmente, passagem em meio rico deve preceder geração de gametas. <ol><li> Cepas para ser acoplado são transferidos para placas TAP (100 × 15 mm), 1-2 cepas por placa. As células devem ser cultivadas em uma faixa concentrada cerca de 1 cm de largura. </li><li> Incubação em placas TAP deve continuar até que uma espessa camada de forma robusta as células de crescimento está presente, com as transferências intermediárias, se necessário. Cepas que não foram recentemente várias passagens podem exigir uma passagem e um total de uma semana, enquanto que linhagens selvagens em uso regular pode levar apenas alguns dias e sem passagens. Mutantes que são sensíveis à luz pode necessitar de tempo adicional. </li><li> Transferência de todas as células das placas TAP para placas de N10, que são deficientes de nitrogênio e começarão a induzir a gametogênese. Transferência das células como uma laje de espessura, tanto quanto eles estavam presentes na placa TAP. Isso irá facilitar a recolha subsequente das células. Após 3 dias em N10, as células são preparados para passar gametogênese. Divisão celular será lenta no N10, no entanto as células devem permanecer verde escuro. Qualquer cepas contaminados devem ser descartados como zigotos viáveis ​​não será obtida. </li></ol> Parte 2: Acasalamento <ol><li> Cada cepa é transferido para um erlenmeyer de 50 ml e ressuspenso em aproximadamente 2,5 ml de água destilada estéril. Isto pode ser feito usando um laço de arame ou um pedaço de pau estéril; o que é importante é que as células estão bem suspensa, e não em grupos. O volume exato de água deve ser ajustada de modo que a concentração de células, como medido por olho, é aproximadamente o mesmo para cada estirpe. </li><li> Células são agitadas sob a luz forte (1,260 E μ / m 2 / s) por 2 horas, tempo durante o qual as células se tornará gametas móveis. Motilidade deve ser verificada com um microscópio de luz. Se os gametas estão nadando mal, o acasalamento é susceptível de ser ineficiente. No entanto, mesmo mal cepas móveis será companheiro de uma freqüência reduzida. </li><li> Em seguida, volumes iguais de mt mt + e-gametas são combinados em um único frasco ml 50. Gametas são deixados sob a luz forte (1,260 E μ / m 2 / s), sem agitação. </li><li> Acasalamento pode ser verificado imediatamente sob o microscópio de luz. Pares de gametas formam rapidamente, e aparecerá como células que se move rapidamente juntou-se ao flagelo. Se o acasalamento parece ser extremamente rápida, as amostras devem ser tomadas no prazo de 30 hr min -1 para a geração de zigotos. Se não, o acasalamento pode ser verificado a cada hora, embora isto seja opcional. Desde os tempos dando a densidade ideal de zigotos irá variar muito entre cruzes, é melhor tomar alíquotas da mistura de acasalamento em diferentes momentos após a combinação de gametas, por exemplo, após 1 hora, 2 horas, 3 horas e 4 horas. Isto é feito através da transferência de 300 amostras mL a TAP-3% agar Difco 60 × 15 placas mm; pontos 3-4 por prato. Tenha cuidado para não agitar a mistura de acasalamento, pois isso pode atrapalhar os casais. Difco agar é usado porque ele tem menos de contaminantes de menor preço ágares, e será mais fácil ver zigotos sob o microscópio. A mistura de acasalamento não utilizado pode ser deixado no frasco durante a noite, ea qualidade da reação de acasalamento será óbvio no dia seguinte. Quando o acasalamento é eficiente, os zigotos irá aderir à parede ou fundo do frasco eo meio será claro. Mesmo agitação do frasco deixará de desalojar os zigotos. Se varas nada para o vidro quando a mistura é agitada com vigor razoável, de acasalamento, em seguida, foi ineficiente ou não ter lugar. </li><li> As placas TAP Difco contendo mistura de acasalamento são secos em uma capa estéril, com as tampas abertas, até que o líquido de superfície tenha sido absorvida. As placas são geralmente deixados à luz (700 NE / m 2 / s) por 18 horas, em seguida, embrulhado em papel alumínio, uma vez que a maturação zygospore só terá lugar no escuro. As cepas cruzou, o acasalamento hora ea data são escritos em ambas as placas e as folhas. Placas são armazenados 5 a 7 dias e podem ser mantidos por mais tempo, embora a eficiência de germinação do zigoto declina progressivamente. </li></ol> Parte 3: Dissecção Tétrade <ol><li> Células vegetativas deve ser raspada manchas secas de mistura de acasalamento usando uma lâmina cega, como um bisturi. A lâmina pode ser usada para expor uma área de zigotos, que vai ficar bem para o ágar 3%. Este passo é feito geralmente no período da tarde, para que os zigotos têm germinado na manhã seguinte, mas não submetido a uma divisão, segundo vegetativo querendimento de 8 progênie. biólogos Chlamydomonas aprender rapidamente a reconhecer zigotos sob o microscópio, já que eles são maiores do que as células vegetativas, e apresentam uma parede grossa zygospore que dá um contorno preto. Zygospores muitas vezes aparecem amarelo, mas também pode ser um pouco verde. O personagem mais importante é que eles furar a agar, enquanto as células vegetativas são prontamente mudou de lado. No entanto, se as placas são excessivamente seco este não será o caso. Além disso, se a mistura de acasalamento era muito denso, zigotos podem formar uma esteira que vai fazer a transferência de zigotos individuais difícil ou impossível. Densidades adequadas são estabelecidas no passo 2.1, e serão rapidamente aprendeu com a experiência. </li><li> Agulhas de vidro são preparados para a recolha de zigotos e separando progênie tétrade. Estes são preparados por puxar três bastões de vidro mm em uma pequena chama para gerar um fio longo e fino, que pode ser quebrada. As dicas destes extremidades afiladas são suavizadas ou dobrado em ganchos, por aquecimento em um breve fogo baixo (álcool ou um fósforo aceso). Prepare 3 ou mais agulhas de vidro, uma vez que eles quebram facilmente, especialmente para usuários inexperientes. </li><li> Zigotos estão reunidos na 3% placa TAP Difco, usando uma agulha de vidro em uma pilha pequena. Um quadrado de agar (até 0,5 cm 2), contendo os zigotos é formado e retirado com um bisturi maçante. Então, o bloco de agar é colocado de bruços sobre a 15 mm Placa de 1,5% TAP Difco, e deslizou ao longo de uma linha horizontal de cerca de 1,5 cm do topo da placa, para distribuir os zigotos. A linha superior horizontal, e uma grade com cerca de 1,5 cm horizontal e 0,5 cm vertical espaçamento são gravados na parte de trás das placas. A grade será utilizado no dia seguinte como um guia para separar a progênie tétrade (a grade também pode ser gravado no dia da dissecção). Finalmente, zigotos individuais são mover-se para as intersecções das linhas horizontal superior com cada linha vertical, com cerca de 20-30 zigotos por placa. Embora somente 12 ou assim vai ser dissecado, nem todos os zigoto germina, e alguns vão dividir duas vezes antes de estourar, então zigotos extras são necessários. </li><li> Após distribuir os zigotos e células vegetativas que foram acidentalmente transferidos da placa de ágar 3% são mortos por exposição da placa invertida por 30 segundos sobre um prato de vidro contendo uma camada (1-2 mm) de espessura de clorofórmio. A distância entre a placa eo clorofórmio devem ficar cerca de 5 cm. Se clorofórmio é muito usado, ou se a distância for muito pequena ou grande, se arrisca quer o abate zigotos, ou não matar as células vegetativas. O tratamento clorofórmio deve ser feito imediatamente após a zygospores foram distribuídos na chapa de germinação, para garantir a seletividade. </li><li> Germinação leva 16-20 horas para a maioria das cepas, mas vai variar com o genótipo e com a idade dos zigotos. Para a germinação, as placas são colocadas sob pouca luz (239 NE / m 2 / s), ou em luz média esmaecido, cobrindo a placa com um lenço de papel. </li><li> Zigotos germinadas podem ser identificados sob o microscópio as células inchadas ou às vezes estourar com células-filhas dentro deles. Se o zygospore não rompeu, tocando suavemente com uma agulha de vidro vai quebrar a parede, se a germinação ocorreu. Células-filhas são suavemente arrastada para os pontos de grade abaixo do zigoto. É mais fácil fazer isso através da captação da célula de uma pequena quantidade de meio líquido liberado do ágar pela pressão da agulha de vidro, e arrastando essa &quot;poça&quot; por trás da agulha. Uma forma de &quot;seguro&quot; de que se tem dissecou um zigoto e não uma célula vegetativa que tem o dobro dividido, é que além da filha de quatro células, a &quot;pele&quot; da parede zygospore permanecerá. </li><li> A progênie dissecados são cultivadas em condições adequadas até clonies visível podem ser colhidas para análise posterior. As placas devem ser monitorados diariamente para a contaminação. </li></ol> Nota: Geração de diplóides vegetativo não é coberto aqui, mas envolve essencialmente a mistura de revestimento de acasalamento em meio que não irá apoiar o crescimento de qualquer cepa parental, mas vai apoiar o crescimento do diplóide (por exemplo, dois marcadores auxotropic diferentes). Placas são mantidas na luz para evitar a formação de zigotos.

<ol>
	<li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chlamydomonas+Sourcebook:+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use.">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 119-273 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Análise genética é simples em Chlamydomonas, mas exige técnicas específicas para gerar gametas e progênie tetrad separado. Com cepas saudável, as técnicas são facilmente adquiridos. Com alguns mutantes, torna-se mais de uma arte, e os leitores devem consultar Volume 1 do Livro de Chlamydomonas recentemente publicado por notas históricas e dicas práticas. Além disso, deve-se notar que há muitas variações sobre o tema básico descrito acima, que vão desde o método para induzir g...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CC-125</td>
<td>Mating type plus strain</td>
<td>Chlamydomonas Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CC-124</td>
<td>Mating type minus strain</td>
<td>Chlamydomonas Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris-Acetate-Phosphate (TAP) </td>
<td>Growth medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N10</td>
<td>Growth medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Difco agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Stainless-Steel Blades</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-916-5B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Surgical Blade Handles</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-914-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Metal Scalpels</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-920A</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mating and tetrad separation of chlamydomonas reinhardtii for genetic analysis

A alga verde unicelular<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt; (<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;) Tornou-se um organismo popular para pesquisas em diversas áreas da biologia celular e genética por causa do seu ciclo de vida simples, facilidade de cultivo e manipulação de análise genética, genômica recursos, e transformabilidade do núcleo e ambas as organelas. Cepas de acasalamento é uma prática comum quando abordagens genéticas são usados ​​em<em&gt; Chlamydomonass</em&gt;, Para criar diplóides vegetativo para a análise de dominância, ou após a dissecção tetrad à herança nuclear vs organellar verificar, testar alelismo, para analisar epistasia, ou para gerar populações com a finalidade de mapa-base de clonagem. Além disso, cruzamentos genéticos são usados ​​rotineiramente para combinar com genótipos organellar especial genótipos nuclear. Aqui demonstramos métodos padrão para a gametogênese, o acasalamento de germinação, zigoto e separação tétrade. Este protocolo consiste de uma série fácil de seguir de etapas que farão abordagens genéticas passíveis de cientistas que estão menos familiarizados com<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;. Parâmetros-chave e pontos de conflito são explicados. Finalmente, os recursos para obter mais informações e métodos alternativos são fornecidos.

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Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Acasalamento e separação tetrad são necessários para análise genética em<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt;. Aqui demonstramos métodos padrão para a gametogênese, o acasalamento de germinação, zigoto e dissecção tétrade. Este protocolo consiste de uma série fácil de seguir de etapas que farão abordagens genéticas passíveis de cientistas que estão menos familiarizados com<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;.

Acasalamento e separação da Tétrade Chlamydomonas reinhardtii Para análise genética

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

19.8K visualizações.  Cornell University. Acasalamento e separação tetrad são necessários para análise genética em Chlamydomonas reinhardtii. Aqui demonstramos métodos padrão para a gametogênese, o acasalamento de germinação, zigoto e dissecção tétrade. Este protocolo consiste de uma série fácil de seguir de etapas que farão abordagens genéticas passíveis de cientistas que estão menos familiarizados com Chlamydomonas.

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Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Claro / escuro Teste de transição para Ratos

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Biologia

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Método para coloração Whole Mount anticorpos em Pintainho

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Ensaio para Indução Neural no embrião de galinha

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissecção do giro denteado do hipocampo de rato adulto

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, Manutenção e Análise Genética

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Eletroporação, Isolamento e imagem das miofibras

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...