Com o crescente interesse em terapias celulares, novos métodos para avaliar a funcionalidade dessas células são necessários. Este protocolo permite a avaliação in vitro a longo prazo da enxertia celular em um contexto neural. As principais vantagens desta técnica é que todos os componentes vêm de origem humana.
Além disso, o enxerto pode ser facilmente rastreado, e o ambiente do organoide pode ser facilmente alterado, o que permite testar diferentes drogas ou tipos de tratamentos. Quem demonstrará essa técnica será Iliana Ibanez, uma talentosa aluna de doutorado em meu laboratório. Comece removendo a suspensão de célula única de células-tronco pluripotentes induzidas ou células progenitoras neurais derivadas de iPSC, ou NPCs, do gelo e centrifugando-as a 300g por cinco minutos a 4 graus Celsius.
Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 3 miligramas por mililitro de matriz de membrana basal solubilizada para obter um volume final de dois microlitros por injeção. Coloque imediatamente a suspensão de volta no gelo até o uso. Transfira a seringa pré-refrigerada do congelador de 20 graus Celsius para um balde de gelo para uso posterior.
Em seguida, remova a placa organoide cerebral da incubadora e transfira o organoide para um prato de 35 milímetros usando uma ponta de furo largo. Para estabilizar os organoides e facilitar a injeção, remova o meio tanto quanto possível sem danificar o organoide. Coloque a placa de 35 milímetros contendo o organoide sob um microscópio dissecante para facilitar a injeção.
Quando os organoides estiverem prontos para injetar, ressuspenda suavemente as células NPC marcadas com EGFP usando uma ponta de pipeta P20 resfriada e mova dois microlitros dessas células para uma lâmina de vidro estéril pré-refrigerada. Pegue uma seringa de insulina pré-cheia do gelo e retire lentamente os 2 microlitros de suspensão celular com o bisel da agulha virado para baixo. Abra a tampa da placa que contém o organoide antes de focar o microscópio nele.
Segure o prato com uma mão, coloque o bisel da agulha para cima. E com a outra mão, injetar a célula lentamente na superfície organoide. Depois de injetar as células, coloque a tampa de volta no prato e incube o organoide injetado por um a dois minutos.
Em seguida, adicione suavemente 500 microlitros do meio organoide à placa antes de transferir o organoide para uma placa de 24 poços com uma ponta de furo largo. Incubar o organoide a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com uma mudança completa do meio a cada dois dias. Coloque um organoide de controle negativo ou não injetado em um microscópio de fluorescência.
E defina a intensidade de iluminação entre 1 e 2 e o tempo de exposição entre 80 e 100 milissegundos para autofluorescência mínima. Em seguida, carregue o organoide de controle positivo e aumente o tempo de exposição para garantir que as células marcadas sejam visíveis. Reposicione o organoide com uma ponta de pipeta de furo largo para encontrar a proteína fluorescente verde reforçada ou a região EGFP plus para injeção.
Retire completamente o meio do organoide antes de carregar o organoide. E crie uma imagem com as configurações selecionadas. Quando a imagem estiver completa, adicione imediatamente um meio fresco para evitar que o organoide seque.
Depois de repetir a remoção do meio e imagem para todos os organoides, retornar os organoides à incubação normal e mudanças do meio. Repita a imagem nos intervalos desejados. Coloque a lâmina em um frasco de coloração Coplin cheio de tolueno por dois minutos e repita esta etapa.
Em seguida, transfira a lâmina de vidro para um frasco de coloração de lâmina Coplin de vidro preenchido com álcool etílico a 100% por dois minutos. E repita este passo antes de transferir a lâmina para um frasco Coplin cheio de água por dois minutos. Repita a lavagem com água.
Em seguida, coloque um recipiente plástico no banho-maria, garantindo que o plástico não toque no fundo do banho. Despeje o tampão citrato dentro do recipiente plástico e deixe atingir 95 a 100 graus Celsius. Assim que o tampão atingir a temperatura desejada, coloque as lâminas dentro do tampão e cubra o recipiente com uma tampa, deixando as lâminas dentro do banho-maria por 30 a 40 minutos.
Após a incubação, retire o recipiente plástico do banho-maria e deixe esfriar em temperatura ambiente por 20 minutos. Lave as lâminas três vezes por dois minutos cada com PBS. Remova o PBS com um lenço de papel sem tocar na amostra.
Prepare o tampão de permeabilização e encha um frasco de coloração de lâmina de vidro com ele. Imergir as lâminas no tampão de permeabilização e incubar por 10 minutos. Repita três lavagens de PBS por dois minutos cada.
Em seguida, prepare a mistura de coloração para cobrir cada amostra e adicione 25 microlitros à lâmina organoide antes de incubar a lâmina à temperatura ambiente por uma hora. Após a incubação, repita três lavagens de PBS por dois minutos cada, e remova os sais enxaguando a lâmina com água destilada dentro de um frasco de coloração de lâmina de vidro. Em seguida, adicione 10 microlitros de líquidos e DAPI a cada amostra antes de obter imagens da lâmina usando o microscópio de fluorescência.
Para o frasco de coloração Coplin de vidro preenchido no meio do caminho com tampão de têmpera 2X, adicione 45 mililitros de PBS e coloque as lâminas dentro deste frasco. Incube o frasco durante a noite a 4 graus Celsius. Use microscopia de fluorescência para verificar se os fluoróforos foram efetivamente extintos antes de repetir a coloração e a imagem.
Uma clara dependência da dose de fluorescência de GFP estava presente no número de células de entrada, com detecção consistente de EGFP mais adesivo celular em 10.000 células e acima. Os organoides injetados e controles com imagem positiva para EGFP mostraram a persistência do local injetado durante todo o período de rastreamento de quatro meses. Adesivos celulares adicionais positivos para EGFP apareceram nove dias após o transplante e persistiram até o desfecho do estudo, indicando a migração das células e integração em seus novos locais.
Em uma maior magnificação, observou-se morfologia neural clara com projeções longas no organoide, confirmando a integração das células injetadas. A coloração inicial de rodada única confirmou a presença de células EGFP plus no local da injeção, incluindo uma mistura de células que retêm o status NPC, e aquelas que se diferenciaram em direção a um destino neural. Para os organoides controle e injetados, muito poucos Nestin mais NPCs foram observados, com a maioria de TUJ1 mais neurônios maduros imaturos.
A coloração de duas rodadas deu mais detalhes, revelando neurônios maduros ao redor da maior parte da região externa do organoide, com áreas de neurônios imaturos em direção ao meio. Astrócitos estavam presentes nos organoides injetados e controle, e foram intercalados ao redor das bordas externas. O corte para o qual a coloração de duas voltas foi realizada no organoide injetado mostrou uma pequena colônia satélite de EGFP mais células distantes do local da injeção que adotaram o fenótipo de neurônios maduros.
Algumas dessas colônias parecem estar próximas aos astrócitos. No entanto, nenhum EGFP mais células com sobreposição completa à coloração GFP sugeriu que elas eram adjacentes em vez de gerar os próprios astrócitos. Quando você está injetando o organoide é que você tem que evitar aplicar muita força ou fazê-lo muito rápido, como você pode destruir o organoide completamente.
Assim, após o rastreamento da vida, os organoides podem ser associados e usados para análise de citometria de fluxo ou abordagens de sequenciamento de célula única. Isso nos permitirá conhecer o estado molecular das células. Essa técnica pode ser extremamente útil para o avanço da terapia celular para doenças neurodegenerativas, inclusive para a modelagem de tumores cerebrais ou metástases.
