Agradecemos ao Dr. Roger Erickson por seu apoio e assistência na preparação do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional do Câncer, no Instituto Nacional de Saúde (Grant Número RO1CA177984; RO1CA138642), projeto de programa VA sobre o câncer de próstata (BX001604).

Foram obtidas amostras de câncer de próstata fresco congelado-fixada em formalina, embebidos em parafina (FFPE) ou a partir do SFVAMC. Amostras eram de pacientes com câncer de próstata submetidos à prostatectomia radical em SFVAMC. Termo de consentimento informado foi obtido de todos os pacientes eo estudo foi aprovado pelo Comitê UCSF em Pesquisa com Seres Humanos. Alternativamente, tecidos de câncer de próstata microarrays foram adquiridos a partir de fontes comerciais e utilizados para análises de miRNA por ISH. Informações clínico-patológico e acompanhamento para pacientes com câncer de próstata analisados ​​foram coletados. 1. As amostras de tecidos <ol><li> Cortar amostras de tecido da próstata câncer em 10 mm seções usando um micrótomo e mancha com H &amp; E seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Comente lâminas coradas para a identificação de focos de câncer de próstata, bem como epitélio glandular normal adjacente. Nota: A placa certificada patologista deve rever os slides H &amp; E manchada e maRK para o tumor e zonas normais. Use os slides marcados como guias nas seções subseqüentes para miRNA análises de tumor vs áreas normais. </li></ol> 2. miRNA expressão quantitativa Análises por PCR em tempo real Nota: Esse fluxo de trabalho envolve as seguintes etapas: Captura de Laser microdissection, isolamento de RNA total (incluindo miRNA e mRNA), ensaio de miRNAs maduros usando os ensaios de expressão TaqMan MicroRNA conforme detalhado nas seções seguintes. <ol><li> Extração de RNA <ol><li> Isolamento de miRNA de cancro da próstata tecidos FFPE <ol><li> Captura Laser microdissection (LCM) Nota: Siga as etapas 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 em um exaustor química. <ol><li> Preparar lâminas de tecido (10 mm seções) para LCM. Deparrafinize secções de tecido por imersão em xileno (2x), durante 10 min cada, em seguida, re-hidratar os tecidos através da incubação das lâminas durante 5 min cada em etanol graduado (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) seguido por destilada água(5 min). </li><li> Após reidratação, as secções com hematoxilina mancha durante 30 seg seguido de água. </li><li> Coloque tecidos em etanol graduado (70%, 95%, 90%, 80%, 70%) (5 min cada) e xileno (5 min). </li><li> Lâminas secas em um exaustor e, em seguida, colocar no instrumento LCM para microdissection. </li><li> Execute microdissecações com o Sistema de LCM de acordo com as instruções do fabricante 24. Uso patologista marcado lâminas como guias para a identificação de focos de cancro da próstata, bem como o tecido normal adjacente. Use o feixe de laser em uma pulsos 10-20 mm de diâmetro com uma potência de 70-90 mW. </li><li> Áreas de captura de interesse com pulsos de laser infravermelho em bonés LCM. Combinar células de 2-5 cápsulas para a extração de miRNA por amostra. Para garantir a integridade de ARN extraído, imediatamente processar células capturadas para extracção miARN. </li><li> Alternativamente, as células lisam em tampão de extracção de miARN (de acordo com o protocolo do fabricante) e STOre lisados ​​a -80 ºC. </li></ol></li><li> miARN Extracção e análises de LCM microdissecadas tecidos <ol><li> Extrair o ARN total a partir de tecidos FFPE microdissected utilizando um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante. Nota: O rendimento de RNA de captura a laser miscrodissection é geralmente baixa. Portanto, o RNA é fluido em volumes baixos (20-30 ul) e utilizada para criação de perfil de expressão, utilizando ensaios de expressão de microRNA Taqman seguintes instruções do fabricante (também descrito na seção 2.2). Optimização de ARN de entrada para detecção por PCR em tempo real de miARNs maduras sugere que o 5 ul do ARN eluído é óptima para cada reacção de transcrição reversa miARN-específicos. Como um controle endógeno, RNU48 / RNU24 é usado. Para as reacções de controlo, 2 ul do ARN eluído foi utilizado para a reacção de transcrição reversa. </li></ol></li></ol></li><li> Isolamento de miRNA de cancro da próstata tecidos congelados <ol><li> Homogenhecer tecidos da próstata ressecados congelados por trituração dos tecidos em azoto líquido usando um almofariz e pilão. Transferir tecido homogeneizado para um tubo de microcentrífuga utilizando uma espátula arrefecida. Manter a argamassa / pilão e uma espátula à mesma temperatura por imersão em azoto líquido então homogeneizado de tecido pode ser facilmente transferido. </li><li> Adicionar comercial de isotiocianato de guanidina-fenol reagente (1 mL / 0,1 g de tecido) para o tecido homogeneizado e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Nota: Os tecidos homogeneizados em reagente isotiocianato de guanidina-f enol comercial pode ser armazenado a -80 ° C durante vários meses. </li><li> Adicionar clorofórmio ao homogeneizado (0,2 ml de clorofórmio / mL) e agitar vigorosamente durante 30 segundos. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 3-5 minutos, seguido por centrifugação a 10.000 xg durante 20 min a 4 ºC. </li><li> Transferir a fase aquosa superior a um tubo de 1,5 ml estéril fresco livre de RNase. </li><li> Adicionar um volume igual de álcool isopropílico. Misturar e incubar por 10 miN, à TA, seguido por centrifugação a 12.000 xg durante 20 min a 4 ° C para sedimentar a ARN. </li><li> Aspirar o sobrenadante e lavar o sedimento de ARN com 1 mL de etanol a 70%. Centrifuga-se a 12000 xg durante 10 min a 4 ºC. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Sedimentos de RNA secar à temperatura ambiente durante 5-10 min. Dissolver RNA em 50-100 ul de água livre de nuclease. </li><li> Realizar quantificação de ARN utilizando um espectrofotómetro NanoDrop determinar a integridade de ARN e com um Bioanalyzer. Ajustar a concentração de ARN e 10 ng / ul. Use 10-50 ng RNA para miRNA- reação cDNA específico seguido por análises em tempo real PCR (Seção 2.2). </li></ol></li></ol></li><li> PCR quantitativa em tempo real para análises de expressão de miARN Nota: miARNs maduros ensaio utilizando um protocolo de duas etapas de RT-PCR tal como descrito abaixo. <ol><li> Transcrição Reversa (RT) <ol><li> Realizar a transcrição reversa de ARN a partir de ADNc utilizando um kit de transcrição reversa miARN em conformidade com as instruções do fabricante.Use de 10-50 ng de ARN total com miARN iniciador específico do kit MicroRNA Ensaios e RT. Use RNU48 / RNU24 / RNU6B como controles. Dilui-se ADNc de 1: 5 a 1:10 (dependendo da abundância de miARN analisados) e utilizar na detecção em tempo real de PCR tal como descrito no passo seguinte. </li></ol></li><li> PCR em tempo real para detecção de miRNA maduro <ol><li> Amplificar produtos de PCR de amostras de ADNc utilizando os ensaios MicroRNA com uma mistura mestre universal de modo rápido de acordo com as instruções do fabricante. Normalizar amostras para RNU48 / RNU24 controle / RNU6B. Usar o método comparativo Ct (limiar de ciclo) para calcular as alterações relativas na expressão do gene no rápido tempo real do sistema de PCR. Analisar cada amostra em triplicado. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. miRNA expressão análises por hibridação in situ (ISH) <ol><li> Pré-tratamento de tecidos <ol><li> Corte 5 mm de blocos de tecido de câncer de próstata FFPE usando um micrótomo. </li><li&gt; Fix secções de tecido através da incubação das lâminas a 56 ° C durante 1 h. Nota: As lâminas podem ser armazenadas à temperatura ambiente durante várias semanas para análises miARN. </li><li> Deparrafinize os tecidos por imersão das lâminas com xileno (2 x), durante 15 min cada. </li><li> Reidratar os tecidos através da incubação das lâminas durante 5 min cada em etanol graduado (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%), seguido por água destilada (5 minutos). </li><li> Fixar as lâminas com paraformaldeído a 4% em PBS à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Lavam-se as lâminas com PBS (2x) à temperatura ambiente durante 5 min cada. </li><li> Tratar as lâminas com 10 ug / ml de Proteinase K a 37 ° C durante 10 min em tampão de proteinase K pré-aquecido (5 mM Tris-HCl pH 7,4, EDTA 1 mM, NaCl a 1 mM). </li><li> Seguindo o tratamento com proteinase-K, enxaguar as lâminas com 0,2% de glicina em PBS durante 30 segundos. </li><li> Lavagem das lâminas em PBS (1x) à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Fixar as lâminas com paraformaldeído 4% em PBS durante 15 min. </li><li> Lavar as lâminas comPBS durante 5 min. </li></ol></li><li> Hibridização <ol><li> Pré-hibridar as lâminas com solução de pré-hibridação durante 3-4 horas a 55 ° C numa câmara humidificada. Use lenços de laboratório de tecido embebido em formamida 50% / 50% 5x SSC para manter a câmara úmida. </li><li> Use 5 &#39;sondas marcadas com digoxigenina a uma concentração de 20-50 nM em tampão de hibridação. Diluir sonda específica para miRNA (20-50 nM) e sonda de controlo U6 pequeno RNA nuclear (20 nM), aquecer a 90 ºC durante 4 minutos, coloque-o no gelo, e adicionar ao gelo tampão de hibridação frio (2-4 ng / mL ). </li><li> Remoção da solução de pré-hibridação, adicionar solução de hibridação (sonda + tampão de hibridação, 100 ul por slide), incubar durante 12-16 horas a sonda de temperatura específicas de hibridação (temperatura = hibridação sonda-21 Tm ºC). Realizar hibridações em uma câmara humidificada (50% de formamida / 50% 5x SSC). </li></ol></li><li> Lavar Passos <ol><li> Lavam-se as lâminas com 2x SSC durante 10 min a 45 ºC. </li><li> Wash tele desliza com SSC 1,5x durante 10 minutos a 45 ºC. </li><li> Lavar as lâminas com SSC 0,2x (2x) a 37 ºC durante 20 minutos cada. </li><li> Incubar as lâminas com solução de bloqueio 1x durante 1-2 horas à temperatura ambiente </li></ol></li><li> Detecção <ol><li> Incubar as lâminas com 1: 100 PBS diluído anticorpo anti-digoxigenina conjugado AP-para 1-4 horas ou durante a noite a 4 ºC. </li><li> Lavam-se as lâminas com PBS (3x), temperatura ambiente, durante 10 min cada. </li><li> Lavar as lâminas (2x) com fosfatase alcalina de tampão (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20) à temperatura ambiente durante 5 min cada. </li><li> Incubar as lâminas em substrato BM roxo AP no escuro à temperatura ambiente durante 1-20 horas. </li><li> Lavar as lâminas com PBS contendo 0,1% de Tween-20 e de lavagem (2x) em água. </li><li> Montar as lâminas utilizando uma mídia de montagem aquosas e examinar ao microscópio. </li></ol></li></ol>

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The authors have no financial disclosures.

Neste artigo, descrevemos um fluxo de trabalho simplificado para criação de perfil de expressão de miRNA em FFPE arquivados ou tecidos clínicos de câncer de próstata fresco congelado. No cancro da próstata, diversos estudos sugerem um papel importante na iniciação da microARNs cancro da próstata, progressão e metástase. No entanto, resultados conflitantes são frequentemente obtidos em um determinado miRNA 22 desde a extração de miRNA e analisa métodos diferem amplamente. Em vista da evidência...

O câncer de próstata é um tumor maligno masculino comumente diagnosticado que é uma das principais causas de mortalidade relacionada com câncer entre os homens. Nos EUA, uma 220,800 novos casos estimados e 27.540 mortes serão relatados em 2015 1. O câncer de próstata é uma doença heterogênea com doença altamente variável course- tumores podem ser indolente ou muito agressivo. Um desafio crítico no manejo clínico do câncer de próstata é representada pela inadequação dos atualmente utilizados métodos / biomarcadores para o rastreio da doença, diagnóstico, prognóstico e tratamento 2. Métodos de rastreio atuais incluem antígeno (PSA), em específico da próstata e um exame de toque retal (DRE), seguido de biópsias de próstata 3. Antígeno específico da próstata (PSA) é o biomarcador de câncer de próstata mais amplamente utilizado que revolucionou significativamente a gestão clínica e melhoria das taxas de sobrevivência 4. No entanto, devido às limitações inerentes de PSA incluindo lack de especificidade, o rastreio baseada em PSA levou a mais de diagnóstico e tratamento ao longo da doença. Em vista disso, os esforços intensivos estão sendo direcionados para a busca de biomarcadores de câncer de próstata alternativos, especialmente aqueles que podem prever a agressividade da doença e tomar melhores decisões de tratamento 4,5. Ao longo dos últimos anos, microRNAs (miRNAs) surgiram como promissoras biomarcadores de câncer de próstata suplentes. Os microRNAs (miRNAs) constituem uma classe evolutivamente conservadas de pequenos RNAs não-codificantes que suprimem a expressão gênica pós-transcricionalmente através de interacções específicas para a sequência com os 3&#39;- não traduzidas (UTRs regiões) de alvos de RNAm cognatos. Estima-se que&gt; 60% de mRNAs são alvos de miARNs 6 conservada. miRNA genes estão localizados em regiões intergénicas ou dentro de exões intrões ou de proteína / proteína não-codificantes genes 7. Estes genes são preferencialmente transcrito pela ARN-polimerase II em primamiRNAs ry (pri-miRNAs, vários quilobases de comprimento) que as estruturas secundárias de loop haste em forma de forma hairpin. Estes miRNAs pri-são transformados em miRNAs precursoras (pré-miRNAs, 60-75 nucleótidos de comprimento) que são exportados para o citoplasma e novamente transformadas em miRNAs maduros (18-25 nucleótidos de comprimento) 8-10. miARNs regular processos celulares chave, incluindo a proliferação, desenvolvimento, diferenciação e apoptose 11. Estudos sugerem uma desregulação generalizada de perfis de expressão de miARN em várias malignidades humanas, incluindo cancro da próstata 12-15. perfis de expressão de miARN têm sido relatados para ser amplamente desregulado no cancro da próstata primário e metastático. MiRNA expressão alterada têm sido relacionados com a progressão do câncer de próstata, agressividade e recorrência destacando o potencial prognóstico de miRNAs 12,14,16-19. Um crescente corpo de evidências indicam que os miRNAs desempenham papéis importantes mecanicistas na iniciação do câncer de próstata, o desenvolvimento, o progressoião e metástase. No geral, os miRNAs estão emergindo como biomarcadores alternativas promissoras para o diagnóstico e prognóstico do câncer de próstata que podem distinguir entre tecidos e ajuda normais e cancerosas na estratificação de tumores de próstata 12. Além disso, os miRNAs são alvos importantes para o desenvolvimento de terapias eficazes contra o câncer de próstata 20. Devido ao seu pequeno tamanho e resistência à actividade da RNase endógena, miARNs biomarcadores são estáveis ​​que podem ser facilmente detectadas em tecidos fixados em formalina 21 e 22 em biópsias da próstata. Além disso, os perfis de expressão miARNs foram comparadas em tecidos congelados e fixados em formalina e foram encontrados para ser fortemente correlacionada 21. No entanto, a expressão miRNA perfis em tecidos clínicos de câncer de próstata é muitas vezes um desafio devido à heterogeneidade do tumor, erros de amostragem, a contaminação do estroma etc. O desenvolvimento de miRNAs como biomarcadores eficazes para o cancro da próstata fortemente reliES na sua detecção precisa em tecidos clínicos. Aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho simplificado utilizado em nosso laboratório para a expressão miRNA de perfis FFPE arquivado ou espécimes clínicos de câncer de próstata fresco congelado. Nós empregar uma combinação de PCR quantitativo em tempo real e a hibridização in situ para miARN análises de amostras clínicas, com a ex-rendendo mais informações quantitativas e o último para visualizar a expressão diferencial de biomarcadores potenciais miARN em uma variedade de tecidos. Dentro desse fluxo de trabalho, otimizar as metodologias existentes para a extração de miRNA de FFPE e tecidos da próstata congelados, analisa expressão por Taqman-sonda baseada miRNA RT-PCR e miRNA in situ utilizando técnica de hibridização de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) à base de sondas 23. Sondas à base de LNA oferecem maior sensibilidade e especificidade em relação ao ADN ou RNA-sondas base e permite a detecção robusta de todas as seqüências de miRNA, independentemente do seu conteúdo GC e também permitir que discriminação de famílias de miARN. Nosso protocolo miARN ISH optimizada pode ser aplicada a lâminas de tecido de cancro da próstata ou cancro da próstata Tissue microarrays (TMA), com este último que oferece o potencial para acelerar miARN descoberta biomarcador.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems&#160;</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus Autopix for LCM</td>
			<td>Arcturus/ Life Technologies</td>
			<td>LCM1621/LCM1110</td>
			<td>Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LCM0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy FFPE Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">217504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real Time PCR System&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td>
			<td align="right">4351106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td>
			<td align="right">4366596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Fast Universal PCR master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td>
			<td align="right">4352042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG labeled LNA probe for U6</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>99002-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM Purple AP substrate</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-hybridization solution&#160;</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-1</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization solution&#160;</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-2</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution&#160;</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-8</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP-conjugated anti-digoxigenin antibody</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-7</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting media&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>H-5501&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018">15596-018</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris hematoxylin</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>SL200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin&#160;</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>SL201&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mirna expression analyses in prostate cancer clinical tissues

Um desafio crucial no cancro da próstata (PCA) manejo clínico é representada pela inadequação dos biomarcadores atualmente utilizados para o rastreio da doença, diagnóstico, prognóstico e tratamento. Nos últimos anos, microARNs (miARNs) surgiram como biomarcadores alternativos promissores para o diagnóstico e prognóstico do cancro da próstata. No entanto, o desenvolvimento de miARNs como biomarcadores eficazes para o cancro da próstata depende fortemente de sua detecção precisa em tecidos clínicos. analisa miRNA em amostras clínicas de câncer de próstata é muitas vezes um desafio devido à heterogeneidade do tumor, erros de amostragem, a contaminação do estroma etc. O objetivo deste artigo é descrever um fluxo de trabalho simplificado para análises de miRNA em FFPE arquivado ou espécimes clínicos de câncer de próstata fresco congelado usando uma combinação de -PCR quantitativo em tempo real (RT-PCR) e hibridação in situ (ISH). Dentro desse fluxo de trabalho, otimizar as metodologias existentes para a extração de miRNA de FFPE e congelado tissu próstataes e expressão análises por sonda Taqman-base miRNA RT-PCR. Além disso, nós descrevemos um método otimizado para ISH analisa detecção formiRNA em tecidos da próstata, utilizando ácido nucleico bloqueado (LNA) - sondas de base. Nosso protocolo miARN ISH optimizada pode ser aplicada a lâminas de tecido de cancro da próstata ou cancro da próstata Tissue microarrays (TMA).

Perfil de expressão de miR-203 em amostras clínicas LCM cancro da próstata primário por RT-PCR análises (Figura 1) Análises de RT-PCR da expressão relativa de miR-203 em LCM tecidos de cancro da próstata primário e as regiões adjacentes normais correspondentes foi realizada como descrito no Saini et ai. RNU48 15 foi utilizada como um controlo. A tabela abaixo resume a expressão de miR-203 em relação a tecidos de tumor de cancro da próstata r...

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miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

As análises de expressão de miRNA no câncer de próstata tecidos clínicos

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

mirna-expression-analyses-in-prostate-cancer-clinical-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K visualizações.  University of California San Francisco. Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

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Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Avaliação de Captação de nanopartículas em tumores em tempo real usando imagens intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Medicina

Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Cancer development is a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor cells, immune cells, fibroblasts and endothelial cells. Each type of cells undergoes signaling and functional changes during carcinogenesis. The current challenge for many cancer researchers is to dissect these changes in each cell type during the multiple-step process in vivo. In the last few years, the authors have developed a set of procedures to isolate different cell populations during skin cancer development using K14creER/R26-SmoM2YFP mice. The procedure is divided into 6 parts: 1) generating appropriate mice for the study (K14creER+ and R26-SmoM2YFP+ mice in this protocol); 2) inducing SmoM2YFP expression in mouse skin; 3) preparing mouse skin biopsies; 4) isolating epidermis from skin; 5) preparing single cells from epidermis; 6) labeling single cell populations for flow cytometry analysis. Generation of sufficient number of mice with the right genotype is the limiting step in this protocol, which may take up to two months. The rest of steps take a few hours to a few days. Within this protocol, we also include a section for troubleshooting. Although we focus on skin cancer, this protocol may be modified to apply for other animal models of human diseases.

Carcinogenesis is a process involving interactions between cancer cells and the cancer microenvironment. To dissect the molecular events, one needs to isolate different cell populations at different stages during cancer development. Using a mouse model for basal cell carcinoma, we describe a protocol for cell analyses during carcinogenesis.

Análises população de células da pele Durante Carcinogênese

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

MR Imagem Molecular do cancro da próstata com um pequeno Molecular CLT1 Peptide alvejado agente de contraste

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

Identificação baseada em Microarray de Individual HERV Loci Expressão: Aplicação a descoberta de biomarcadores em câncer de próstata

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Um Modelo murino de próstata humana Metástase Ortotópico

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolamento de células-tronco cancerosas em amostras de câncer de próstata humano

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Formação Mammosphere Ensaio de cancro da mama humano tecidos e linhas celulares

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Geração de paciente com câncer de próstata Derivado modelos de xenotransplante de células tumorais circulantes

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Trabalhando com tecidos humanos para Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2-&#916;&#916;ct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer NSCLC Patients&#039; Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.

Exosomal Análise miRNA em não-pequenas células do cancro do pulmão (NSCLC) dos pacientes Plasma Através qPCR: Um Líquido Biópsia ferramenta viável

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...