A estabilidade do alvo responsivo da afinidade medicamentosa, DARTS, é um método robusto para detecção de novos alvos proteicos de pequenas moléculas. Pode ser usado para verificar interações conhecidas de proteínas de pequenas moléculas e para encontrar potenciais alvos proteicos para produtos naturais. Neste estudo, melhoramos ainda mais as capacidades de análise de dados do experimento DARTS, monitorando as mudanças na estabilidade proteica e estimando a afinidade das interações proteína-ligante.
As interações proteína-ligante podem ser plotadas contra duas curvas, uma curva proteolítica e uma curva de dependência de doses. Usamos a interação mTOR-rapamicina como um caso exemplar para o estabelecimento do nosso protocolo. Cultivar células 293T usando DMEM com soro bovino 10% fetal, glutamina de dois milimônios e antibióticos de 1%.
Incubar as culturas a 37 graus Celsius abaixo de 5% de dióxido de carbono. Quando a cultura atingir 80 a 90% de confluência, lave as células duas vezes com PBS frio. Use um raspador de células para coletar as células em uma quantidade apropriada de tampão de lise celular fria e transferir as células de lise para um tubo de 1,5 milímetros.
Inverta para misturar bem o tampão de lise e as células de lise e incubar o tubo no gelo por 10 minutos. Centrifugar o tubo a 18.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supernante para um novo tubo de 1,5 mililitro e mantenha refrigerado no gelo.
Realize o ensaio BCA para aproximar a concentração proteica de lises e calcular a diluição do pronase com base na concentração proteica. Primeiro, transfira o lysate para dois tubos de 1,5 mililitros, 99 microliters cada. Adicione um microliter de solução de estoque de pequenas moléculas a cada alíquota de lisato e incubar os dois tubos por 30 a 60 minutos em temperatura ambiente com agitação.
No gelo, estabeleça diluições seriais da solução de pronase recém-descongelada em 1x TNC. Após a incubação com a pequena molécula, divida cada alíquota em 20 microlitrais de amostras em cinco tubos. Para garantir o mesmo tempo de digestão, em intervalos específicos de cada 30 segundos, adicione dois microliters das soluções de pronase preparadas às amostras em conformidade.
Para um grupo de controle, adicione dois microliters de buffer TNC. Após cinco a 20 minutos, pare a digestão dos seis tubos através da adição de dois microliters de coquetel inibidor de protease frio de 20x em intervalos de 30 segundos. Misture bem e incubar no gelo por 10 minutos.
Diluir cada amostra com seis microliters de 5x tampão de carga SDS-PAGE e ferver as amostras em um banho de água a 70 graus Celsius por 10 minutos. Agora, para executar a mancha ocidental, carregue quantidades iguais de proteína nos poços de um gel de 8%SDS-PAGE, juntamente com um marcador de peso molecular apropriado. Execute o gel por 30 minutos a 80 volts, depois ajuste a tensão para 120 volts e continue funcionando por uma a duas horas.
Verifique se a pequena molécula pode se ligar diretamente às proteínas alvo potenciais. Neste protocolo, a incubação com a pequena molécula confirmou a proteção contra a proteólise. Três bandas foram encontradas protegidas por incubação com rapamicina sobre o controle do veículo.
A mancha ocidental ilustrou a presença de proteína mTOR em baixas relações pronase/proteína e sua redução e perda com proporções crescentes. A proteólise do mTOR pela pronase foi claramente inibida pela presença de rapamicina e a adição de rapamicina gerou uma mudança óbvia na curva proteolítica. A dose de rapamicina aumentou o nível de mTOR, sugerindo a estabilidade crescente do mTOR com o tratamento da rapamicina.
A quantificação das intensidades da banda proteica alvo sugeriu que o mTOR é a proteína alvo da rapamicina. Para obter o melhor efeito stepwise, este experimento pode ter que ser repetido várias vezes para obter uma faixa adequada de pronase sobre as relações proteicas.
