La stabilità del bersaglio reattiva all'affinità del farmaco, DARTS, è un metodo robusto per il rilevamento di nuovi bersagli proteici di piccole molecole. Può essere utilizzato per verificare le interazioni proteiche note con piccole molecole e per trovare potenziali obiettivi proteici per i prodotti naturali. In questo studio, miglioriamo ulteriormente le capacità di analisi dei dati dell'esperimento DARTS monitorando i cambiamenti nella stabilità delle proteine e stimando l'affinità delle interazioni proteina-ligando.
Le interazioni proteina-ligando possono essere tracciate su due curve, una curva proteolitica e una curva di dipendenza dalla dose. Abbiamo usato l'interazione mTOR-rapamicina come un caso esemplare per la definizione del nostro protocollo. Coltivare cellule 293T utilizzando DMEM con siero bovino fetale al 10%, glutammina bimolare e 1% antibiotici.
Incubare le colture a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Quando la coltura raggiunge l'80-90% di confluenza, lavare le celle due volte con PBS freddo. Utilizzare un raschietto per cellule per raccogliere le cellule in una quantità appropriata di tampone di lisi a celle fredde e trasferire le cellule lisci in un tubo da 1,5 millimetri.
Invertire per mescolare bene il tampone di lisi e le cellule lisci e incubare il tubo sul ghiaccio per 10 minuti. Centrifugare il tubo a 18.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e tenersi refrigerato sul ghiaccio.
Eseguire il saggio BCA per approssimare la concentrazione proteica dei lysati e calcolare la diluizione della pronasi in base alla concentrazione proteica. In primo luogo, trasferire il litolato in due tubi da 1,5 millilitri, 99 microlitri ciascuno. Aggiungere un microlitro di soluzione stock di piccole molecole a ciascuna aliquota di lisato e incubare i due tubi per 30-60 minuti a temperatura ambiente con scuotimento.
Sul ghiaccio, stabilire diluizioni seriali della soluzione di pronasi appena scongelata in 1x TNC. Dopo l'incubazione con la piccola molecola, dividere ogni aliquota in 20 microlitri di campioni in cinque tubi. Per garantire lo stesso tempo di digestione, ad intervalli specifici ogni 30 secondi, aggiungere due microlitri delle soluzioni di pronasi preparate ai campioni di conseguenza.
Per un gruppo di controllo, aggiungere due microlitri di buffer TNC. Dopo cinque o 20 minuti, interrompere la digestione dei sei tubi attraverso l'aggiunta di due microlitri di cocktail inibitore della proteasi fredda 20x a intervalli di 30 secondi. Mescolare bene e incubare sul ghiaccio per 10 minuti.
Diluire ogni campione con sei microlitri di tampone di carico 5x SDS-PAGE e far bollire i campioni in un bagno d'acqua a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Ora, per eseguire western blot, caricare quantità uguali di proteine nei pozzi di un gel 8%SDS-PAGE, insieme a un indicatore di peso molecolare appropriato. Far funzionare il gel per 30 minuti a 80 volt, quindi regolare la tensione a 120 volt e continuare a funzionare per una o due ore.
Verificare che la piccola molecola possa legarsi direttamente alle potenziali proteine bersaglio. In questo protocollo, l'incubazione con la piccola molecola ha confermato la protezione contro la proteolisi. Tre bande sono state trovate protette dall'incubazione con rapamicina sul controllo del veicolo.
L'assorbimento occidentale ha illustrato la presenza di proteine mTOR a basso rapporto pronasi/proteine e la sua riduzione e perdita con rapporti crescenti. La proteolisi di mTOR per pronasi era chiaramente inibita dalla presenza di rapamicina e l'aggiunta di rapamicina generò un evidente spostamento nella curva proteolitica. Rapamicina dose-dipendente ha migliorato il livello di mTOR, suggerendo la crescente stabilità di mTOR con trattamento con rapamicina.
La quantificazione delle intensità della banda proteica target ha suggerito che mTOR è la proteina bersaglio della rapamicina. Per ottenere il miglior effetto graduale, questo esperimento potrebbe essere necessario ripetuto più volte per ottenere una gamma adeguata di pronasi rispetto ai rapporti proteici.
