זיקה לסמים מגיבה ליציבות היעד, DARTS, היא שיטה חזקה לגילוי מטרות חלבון חדשניות של מולקולה קטנה. ניתן להשתמש בו כדי לאמת אינטראקציות ידועות של חלבונים במולקולה קטנה ולמצוא מטרות חלבון פוטנציאליות למוצרים טבעיים. במחקר זה, אנו משפרים עוד יותר את יכולות ניתוח הנתונים של ניסוי DARTS על ידי ניטור השינויים ביציבות החלבון והערכת הזיקה של אינטראקציות חלבון-ליגנד.
ניתן להתוות את אינטראקציות החלבון-ליגנד מול שתי עקומות, עקומה פרוטאוליטית ועקומת תלות במינון. השתמשנו באינטראקציה mTOR-rapamycin כמקרה למופת להקמת הפרוטוקול שלנו. לגדל תאים 293T באמצעות DMEM עם 10% סרום חזיר עוברי, גלוטמין שני מילימולרים, ו 1% אנטיביוטיקה.
דגירה התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. כאשר התרבות מגיעה 80 עד 90%confluence, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS קר. השתמש מגרד תאים כדי לאסוף את התאים לתוך כמות מתאימה של מאגר תות תאים קרים ולהעביר את התאים lysing לתוך צינור 1.5 מילימטר.
להפוך לערבב את חיץ תיזה ותאי lysing היטב דגירה הצינור על קרח במשך 10 דקות. צנטריפוגה הצינור ב 18, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את העל-טבעי לצינור חדש של 1.5 מיליליטר ומצננים על קרח.
בצע בדיקת BCA כדי להעריך את ריכוז החלבון של ליזטים ולחשב את דילול הפרונסה בהתבסס על ריכוז החלבון. ראשית, להעביר את lysate לשני צינורות 1.5 מיליליטר, 99 microliters כל אחד. הוסף מיקרוליטר אחד של פתרון מלאי מולקולה קטנה לכל aliquot של ליט ולהדגר את שני הצינורות במשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר עם רועד.
על הקרח, להקים דילול סדרתי של פתרון פרונס מופשר טרי ב 1x TNC. בעקבות הדגירה עם המולקולה הקטנה, מחלקים כל אליט ל-20 מיקרוליטרים של דגימות בחמישה צינורות. כדי להבטיח את אותו זמן עיכול, במרווחים ספציפיים של כל 30 שניות, להוסיף שני microliters של פתרונות pronase מוכן לדגימות בהתאם.
עבור קבוצת הבקרה אחת, הוסף שני מיקרוליטרים של מאגר TNC. לאחר חמש עד 20 דקות, לעצור את העיכול של ששת הצינורות באמצעות תוספת של שני microliters של קוקטייל מעכבי פרוטאז קר 20x במרווחים של 30 שניות. מערבבים היטב ודגירה על קרח במשך 10 דקות.
לדלל כל מדגם עם שישה microliters של חיץ טעינה 5x SDS-PAGE ולהרתיח את הדגימות באמבט מים ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. עכשיו, כדי לבצע כתם מערבי, לטעון כמויות שוות של חלבון לתוך הבארים של 8%SDS-PAGE ג'ל, יחד עם סמן משקל מולקולרי מתאים. הפעל את הג'ל במשך 30 דקות ב 80 וולט, ולאחר מכן להתאים את המתח ל 120 וולט ולהמשיך לרוץ במשך שעה עד שעתיים.
ודא כי המולקולה הקטנה יכולה להיקשר ישירות לחלבוני היעד הפוטנציאליים. בפרוטוקול זה, הדגירה עם המולקולה הקטנה אישרה את ההגנה מפני פרוטאוליזה. שלוש להקות נמצאו מוגנות על ידי דגירה עם rapamycin על בקרת רכב.
כתמים מערביים המחישו את נוכחותו של חלבון mTOR ביחסי פרונס לחלבון נמוכים ואת הפחתתו ואובדןו ביחסים הולכים וגדלים. פרוטאוליזה של mTOR על ידי פרונס היה מעוכב בבירור על ידי נוכחות של rapamycin ותוספת של rapamycin יצר שינוי ברור בעקומה פרוטאוליטית. Rapamycin מינון תלויה שיפרה את רמת mTOR, מה שמרמז על היציבות הגואה של mTOR עם טיפול rapamycin.
כימות של התעצמות רצועת החלבון היעד הציע כי mTOR הוא חלבון היעד של rapamycin. על מנת לקבל את האפקט הטוב ביותר צעד אחר צעד, ניסוי זה עשוי להיות חוזר על עצמו מספר פעמים כדי להשיג מגוון מתאים של pronase על יחסי חלבון.
