La estabilidad del objetivo sensible a la afinidad de fármacos, DARTS, es un método robusto para la detección de nuevos objetivos de proteínas de moléculas pequeñas. Se puede utilizar para verificar las interacciones conocidas de proteínas de molécula pequeña y para encontrar posibles dianas proteicas para productos naturales. En este estudio, mejoramos aún más las capacidades de análisis de datos del experimento DARTS mediante el seguimiento de los cambios en la estabilidad de las proteínas y la estimación de la afinidad de las interacciones proteína-ligand.
Las interacciones proteína-ligand se pueden trazar contra dos curvas, una curva proteolítica y una curva de dosis-dependencia. Hemos utilizado la interacción mTOR-rapamicina como un caso ejemplar para el establecimiento de nuestro protocolo. Cultivar células 293T usando DMEM con 10%suero bovino fetal, glutamina de dos milivolares y 1%antibióticos.
Incubar los cultivos a 37 grados centígrados por debajo del 5% de dióxido de carbono. Cuando el cultivo alcance entre el 80 y el 90% de confluencia, lave las células dos veces con PBS frío. Utilice un rascador de celdas para recoger las células en una cantidad adecuada de búfer de lelisis de celda fría y transferir las celdas de la lesión a un tubo de 1,5 milímetros.
Invertir para mezclar bien el tampón de la lesis y las células de lesing e incubar el tubo sobre hielo durante 10 minutos. Centrifugar el tubo a 18.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y manténgalo frío sobre hielo.
Realizar el ensayo de BCA para aproximar la concentración proteica de los licatos y calcular la dilución de la pronasa en función de la concentración de proteínas. Primero, transfiera el izado a dos tubos de 1,5 mililitros, 99 microlitros cada uno. Añadir un microlitro de solución de stock de moléculas pequeñas a cada alícuota de izado e incubar los dos tubos durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente con agitación.
En hielo, establezca diluciones en serie de solución de pronasa recién descongelada en 1x TNC. Después de la incubación con la molécula pequeña, divida cada alícuota en 20 microlitros de muestras en cinco tubos. Para garantizar el mismo tiempo de digestión, a intervalos específicos de cada 30 segundos, añada dos microlitros de las soluciones de pronasa preparadas a las muestras en consecuencia.
Para un grupo de control, agregue dos microlitros de búfer TNC. Después de cinco a 20 minutos, detenga la digestión de los seis tubos mediante la adición de dos microlitros de cóctel inhibidor de la proteasa fría 20x a intervalos de 30 segundos. Mezclar bien e incubar sobre hielo durante 10 minutos.
Diluir cada muestra con seis microlitros de 5x tampón de carga SDS-PAGE y hervir las muestras en un baño de agua a 70 grados Celsius durante 10 minutos. Ahora, para realizar Western blot, cargue cantidades iguales de proteína en los pozos de un gel 8%SDS-PAGE, junto con un marcador de peso molecular adecuado. Ejecute el gel durante 30 minutos a 80 voltios, luego ajuste la tensión a 120 voltios y continúe funcionando durante una o dos horas.
Verifique que la molécula pequeña pueda unirse directamente a las proteínas objetivo potenciales. En este protocolo, la incubación con la molécula pequeña confirmó la protección contra la proteólisis. Se encontró que tres bandas estaban protegidas por incubación con rapamicina sobre el control de vehículos.
La hinchazón occidental ilustró la presencia de proteína mTOR a baja pronase a proporciones proteicas y su reducción y pérdida con proporciones crecientes. La proteólisis de mTOR por pronase se inhibió claramente por la presencia de rapamicina y la adición de rapamicina generó un cambio evidente en la curva proteolítica. La rapamicina dependiente de la dosis mejoró el nivel de mTOR, lo que sugiere la creciente estabilidad de mTOR con tratamiento con rapamicina.
La cuantificación de las intensidades de la banda de proteína objetivo sugirió que mTOR es la proteína diana de la rapamicina. Con el fin de obtener el mejor efecto escalonado, este experimento puede tener que repetirse varias veces para obtener una gama adecuada de pronasa sobre las proporciones de proteínas.
