Quando uma determinada função proteica é modificada por manipulação genética, a coordenação da falha irritante e do comprometimento do funcionamento motor é considerada uma condição necessária para a relação causal entre a LTD e a aprendizagem motora. Aqui demonstramos o uso de múltiplos protocolos para avaliar a LTD que pode ser induzida através de mecanismos compensatórios em animais manipulados por genes. Antes de colher o cérebro, esfrie e oxigene dois 50 mililitros de ACSF no gelo.
Quando a temperatura da solução atingir abaixo de quatro graus celsius, adicione 50 microliters de uma tetrodotoxina mililitro a um dos béquers frios de gelo. Para colher o cérebro, segure a cabeça e use uma tesoura oftalmológica para cortar a pele superficial ao longo da linha média. Retrair manualmente a pele para expor amplamente a superfície do crânio e usar a tesoura para cortar ao longo horizontalmente do crânio do grande buraco spinocerebellar para pouco acima dos olhos e ouvidos antes de cortar o crânio ao longo de uma linha acima de ambos os olhos.
Use um bisturi para cortar o cérebro no meio do cerebrum e isolar a parte caudal do cérebro, incluindo o cerebelo, do crânio. Mergulhe a amostra no béquer gelado do ACSF e ajuste a tubulação de bolha para que não mexa o bloco cerebral no béquer. Após pelo menos sete minutos, use uma espátula para pegar o bloco cerebral e use um pedaço de papel filtro para absorver qualquer excesso de ACSF.
Monte o lado ventral do tecido para baixo em um pedaço de ágar de dois por dois centímetros com um adesivo médico apropriado. Use uma lâmina para cortar o hemisfério direito do tecido cerebral o mais paralelo ao plano dendrático das células Purkinje possível. Corte e remova o outro lado do hemisfério e corte o cérebro entre o coliculi superior e inferior.
Corte a medula espinhal e cole o lado direito do cerebelo aparado com o bloco de ágar na bandeja de espécimes pré-refrigerados. Em seguida, inclinando a bandeja do espécime, despeje ACSF na amostra para fixar o tecido e lavar qualquer excesso de cola. Para cortar a amostra cerebral, oriente o espécime de tal forma que o lado dorsal do cerebelo esteja na frente e despeje o suficiente do acsf de corte frio de gelo complementado com tetrodotoxina para imergir completamente o cerebelo.
Coloque um tubo de gás na solução de corte e inicie borbulhando com uma mistura de gás oxigênio-carbono. Usando pinças finas e lupas, remova o aracnoide mater e extire o peduncle cerebelar. Depois de remover o tronco cerebral e o bloco de ágar, gire a bandeja 180 graus para que a superfície dorsal do cerebelo fique de frente para a lâmina de barbear do vibratome e ajuste o primeiro local de corte.
Ajuste a amplitude do vibratome para 5,5 e frequência para 85 Hertz, a velocidade para três a quatro, e a espessura da fatia para 300 micrômetros. À medida que as fatias cerebelares são obtidas, use uma rede de nylon para transferir as seções para uma incubadora de acrílico em um banho de água de 26 graus celsius e imergir completamente as amostras em ACSF oxigenado fresco por pelo menos uma hora. Para relatórios inteiros de grampos de remendo celular, dissolva uma picrotoxina micromolar em ACSF por ultasonicação por três minutos antes de perfundir uma câmara de gravação de 30 graus celsius com a solução de toxina a uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto.
Depois de alguns minutos, transfira uma fatia cerebelar para a câmara de gravação e fixe o tecido com um peso de platina e fios de nylon. Em seguida, encha um eletrodo estimulante com ACSF fresco. Para estimular as fibras paralelas, coloque o eletrodo estimulante na superfície da camada molecular a cerca de 50 micrômetros da camada celular purkinje.
Para estimular as fibras de escalada, coloque o eletrodo estimulante na parte inferior da camada celular Purkinje e use um microcarregador para encher um eletrodo de gravação com oito microliters de 0,45 micrômetros filtrados de potássio ou solução interna baseada em césio. Aplique uma pressão positiva fraca no eletrodo de gravação antes de mergulhar o eletrodo no ACSF. A resistência ao eletrodo deve ser de dois a quatro megaohms e o potencial de junção líquida deve ser corrigido.
Aproxime-se do corpo celular saudável e brilhante de uma célula Purkinje com o eletrodo de gravação e empurre ligeiramente a superfície da célula Purkinje. Em seguida, pare de aplicar a pressão positiva e aplique pressão negativa até que uma vedação gigaohm seja formada. Em seguida, use pressão negativa para estabelecer uma configuração celular inteira, mantendo o potencial da membrana em menos 70 milivolts e aplicando um menos dois milivolt 100 milissegundos pulsos a 0,1 hertz, monitoramento contínuo da resistência de entrada, resistência à série e capacitância de entrada.
Para indução de depressão de longo prazo, estimule a camada molecular com um pulso de 0,1 milissegundo e aplique um estímulo de pulso duplo para identificar as correntes pós-sinápticas de fibra paralela. Deve-se observar uma facilitação de pulso emparelhada e um aumento gradual da amplitude em relação ao aumento da intensidade de estimulação. Para registrar a resposta ao teste, aplique um único pulso de 0,1 hertz e ajuste a intensidade do estímulo para que a amplitude evocada seja de cerca de 200 picoamps.
Estimular as fibras de escalada na parte inferior da camada celular Purkinje e identificar as correntes pós-sinápticas de fibras paralelas provocadas pela ativação da fibra de escalada, aplique um estímulo de pulso duplo. Uma depressão de pulso pareada deve ser observada de forma total ou nenhuma em correlação com o aumento da intensidade de estimulação. Neste experimento representativo, foi utilizada uma conjunção de uma estimulação de fibras paralelas e uma estimulação de fibra de escalada sob as condições atuais do grampo.
A forma do pico complexo provocado pela estimulação conjuntiva foi semelhante à provocada apenas pela estimulação da fibra de escalada com a primeira espeto íngreme seguida de dois a três espinhos. Um pico complexo de forma semelhante foi observado quando uma estimulação de fibras paralelas foi seguida 50 milissegundos mais tarde por um segundo paralelo conjuntivo e estimulação de fibras de escalada. Neste teste sob condições de grampo de tensão utilizando uma solução interna baseada em césio, uma estimulação de fibras paralelas foi seguida 50 milissegundos mais tarde por uma aplicação concomitante de uma segunda estimulação de fibras paralelas e despolarização somática.
Uma corrente interior foi provocada após despolarização somática de menos 70 a zero milvolts e a corrente traseira também foi evocada após a repolarização. Finalmente, cinco estímulos paralelos de fibra a 100 hertz foram dados simultaneamente com a despolarização somática sob condições de grampo de tensão. Mais uma vez, uma geração repetitiva de correntes interiores foi provocada durante a despolarização e a corrente traseira foi induzida após a repolarização.
Para avaliar a relação entre cerebelar LTD e aprendizagem motora em animais manipulados por genes, vários protocolos devem ser usados para induzir LTD em condições fisiológicas aconchegantes. Se a Cerebellar LTD for visualizada em animais manipulados por genes após o aprendizado motor, a relação causal entre eles pode ser mais diretamente examinada.
