A cultura de fatia organotípica é uma poderosa ferramenta para estudar processos neurodesenvolvimentantes e degenerativos ou regenerativos. Esta técnica pode ser usada para testar rapidamente moléculas candidatas para seu potencial neuroprotetor. Este método imita de perto as condições in vivo, em comparação com as culturas celulares primárias dissociadas, à medida que a arquitetura do conjunto tecidual e as conexões células nativas são preservadas dentro dos planos das seções.
Aqui demonstramos o estudo da morte celular de Purkinje no cerebelo em desenvolvimento. Mas a cultura de fatia organotípica é igualmente adequada para modelar doenças neurodegenerativas em quase todas as regiões do sistema nervoso central. Demonstrando o procedimento com Jennifer Rakotomamonjy estará Sean McDermott, um técnico do meu laboratório.
Antes de colher as fatias cerebelares, em um armário de biossegurança esterilizado, preencha cada poço de uma placa de seis poços de cultura com um mililitro de meio de cultura filtrada a vácuo, e adicione o agente farmacológico de interesse aos poços de tratamento, e um volume igual de veículo aos poços de controle. Usando fórceps estéreis, coloque um filtro de membrana PTFE tamanho 0,4 micrômetro em cada poço, tomando cuidado para evitar bolhas na interface de cada membrana e do meio, e equilibre o meio em uma incubadora de dióxido de carbono de 37 graus Celsius e 5% por duas horas. Para colher o cerebelo, use fórceps de curativo reto para agarrar a cabeça do filhote pelo nariz, e use uma tesoura de olho reto para cortar o couro cabeludo da extremidade posterior lateralmente para a linha média.
Corte o crânio da mesma maneira, apontando as pontas da tesoura para fora para evitar danificar o cerebelo, e use uma espátula para transferir o cérebro para um prato de 60 milímetros contendo HBSS frio e cinco miligramas por mililitro de glicose. Use os fórceps de curativo reto para dissecar cuidadosamente o cerebelo e use fórceps finos estéreis para colocar o tecido em um disco plástico na mesa de corte de um helicóptero de tecido. Gire a mesa de corte para orientar o tecido para permitir a aquisição de seções parasagitais e puxe o botão de liberação da mesa para a direita para mover a mesa de corte até que a lâmina esteja posicionada na borda do tecido.
Em seguida, ajuste a espessura da fatia para 350 micrômetros, e a velocidade da lâmina para médio, e ligue o helicóptero. Quando todo o cerebelo tiver sido cortado, desligue o helicóptero. Usando fórceps estéreis, segure o disco sobre um novo prato de 60 milímetros.
Use uma pipeta de transferência para lavar o HBSS mais a glicose sobre o disco para que as fatias caiam no prato. Em seguida, tocando as amostras o mínimo possível, use um microprobe para separar as fatias. Use a pipeta de transferência para selecionar seções do cerebelo perto do vermímis em pastilhas de cultura celular individuais na placa de seis poços e use o microprobe para posicionar as fatias no centro de cada inserção.
Quando todas as fatias tiverem sido colocadas, aspire cuidadosamente qualquer excesso de HBSS mais glicose, e devolva a placa à incubadora de cultura celular. Para coloração de imunofluorescência, remova o sobrenante de cada poço e lave as pastilhas com PBS. Fixar as fatias com um mililitro de paraformaldeído frio de 4% no poço de cada inserção, e 500 microliters em cima de cada inserção por uma hora.
No final da fixação, lave as pastilhas quatro vezes por 10 minutos com um mililitro de PBS fresco sob cada inserção e 500 microliters de PBS frescos em cima de cada inserção por lavagem em um agitador orbital. Preencha cada poço de uma placa de 24 poços com 500 microliters de PBS-TB, e use um pincel para transferir as fatias cerebelares de cada inserção de cultura celular em poços individuais de uma placa de 24 poços. Permeabilize e bloqueie as fatias em temperatura ambiente por uma hora.
No final da incubação, rotule as células com 200 microliters do anticorpo primário de interesse diluído em PBS-TB por poço durante a noite a quatro graus Celsius no shaker orbital. Na manhã seguinte, lave as fatias quatro vezes por 10 minutos e 500 microliters de PBS fresco por lavagem no shaker, antes de rotular as amostras com os anticorpos secundários conjugados fluoróvo apropriados por duas horas à temperatura ambiente no agitador, protegidos da luz. No final da incubação, contra-acerte as seções com 500 microliters de uma mancha nuclear apropriada por poço por 10 minutos à temperatura ambiente, protegidos da luz.
E use uma pipeta de transferência para montar as fatias em lâminas de vidro. Em seguida, deixe as seções secarem completamente antes de reidratar com PBS e montar os tecidos com tampas revestidas com aproximadamente 80 microliters de meio de montagem. Uma vez que o meio de montagem tenha curado, as seções cerebelares estão prontas para serem imagens.
No sexto dia pós-natal, a sobrevivência das células Purkinje é baixa nas amostras de controle, consistente com sua conhecida janela de vulnerabilidade. A sobrevivência aumenta à medida que o animal doador envelhece e sai desse período crítico. O tratamento de fatias cerebelares com alta concentração de cloreto de potássio resulta em indução bem sucedida de sua despolarização e sobrevivência.
Para obter resultados consistentes e reprodutíveis, é fundamental selecionar seções cerebelares saudáveis e realizar a configuração da cultura da forma mais eficiente possível. As aplicações pós-cultura vão além da imunofluorescência. Como fatias organotípicas podem ser usadas para estudos de expressão de proteínas do genoma, e para monitorar a atividade do circuito neuronal usando eletrofisiologia e imagem viva de cálcio.
