Borrelia é um gênero de bactérias espiroquetas que engloba três tipos principais. O grupo Borreliose de Lyme, o grupo Febre Recidivante e o grupo menos bem caracterizado encontrado em répteis. Muitas espécies de Borrelia são patogênicas.
A cultura de bactérias é o padrão-ouro para a detecção de infecção. Isso vale tanto para a pesquisa quanto para o trabalho clínico. A cultura de bactérias de fluidos corporais e tecidos confirma que as bactérias são viáveis e replicantes.
Este protocolo demonstra a metodologia e as receitas necessárias para cultivar e preservar com sucesso o grupo de espiroquetas Lyme Borreliosis, Borrelia de Febre Recidivante e Borrelia miyamotoi. São fornecidos métodos para o cultivo de espécies e cepas previamente isoladas, bem como novos isolados e isolados monoclonais de fontes ambientais ou de mamíferos. Demonstrando o procedimento estarão Marie-Line Faucillion, pesquisadora de pós-doutorado, e Ingela Nilsson, técnica do Bergstrom Lab, Anne Berthold, pesquisadora associada do Lloyd Lab, e Maryna Golovchenko, pesquisadora associada do Rudenko Lab.
Para começar, obtenha os reagentes necessários para preparar um litro de Barbara-Stoner-Kelly, ou meio BSK-II. Comece dissolvendo o BSA em um copo, mexendo a água. Em seguida, adicione todos os produtos químicos secos e deixe-os dissolver antes de adicionar CMRL.
Ajustar o pH do meio para 7,6. Se necessário, use hidróxido de sódio molar. Em seguida, adicione soro de coelho ao meio para uma concentração de seis a 10%Se o crescimento bacteriano não for forte, adicione outro a 2% de soro ao meio.
Em seguida, esterilize o meio usando um filtro de poros de 0,22 mícron. Congele o estoque do meio em alíquotas de 100 ou 400 mililitros. Para cepas de febre recidivante, adicione 100 mililitros de gelatina estéril a 7% a 400 mililitros de meio BSK-II.
Desinfetar a superfície e todos os materiais com etanol a 7% e transferi-los imediatamente para o gabinete de segurança biológica. UV esterilizar todos os materiais não biológicos por cinco minutos antes do início do trabalho. Para iniciar uma cultura, pré-aqueça o meio em uma incubadora.
Em seguida, adicione um mililitro de cultura de Borrelia descongelada de um estoque de glicerol a cinco a 15 mililitros de meio BSK pré-aquecido. Encha os tubos quase completamente para fazer uma atmosfera micro ou anaeróbica antes de fechá-los. Crescem espécies de Febre Recidivante a 37 graus Celsius e espécies de Borrelia burgdorferi sensu lato a 33 a 34 graus Celsius.
Monitorar o crescimento da cultura de Borrelia usando contraste de fase ou microscopia de campo escuro em aumento de 200 a 400 vezes. Para garantir a distribuição uniforme das células, misture a cultura com uma pipeta sorológica ou use uma pipeta de transferência de três mililitros enquanto pipeta para cima e para baixo. Em seguida, carregar para alíquota de cultura de 10 microlitros em cada lado de um hemocitômetro para contagem.
Em seguida, diluir a cultura de Borrelia em fase exponencial na proporção de um para dois ou um para quatro com um meio em um tubo de 1,7 mililitro. Ao determinar a contagem de células, considere o fator de diluição adequadamente. Após o uso, borrifar as superfícies e o hemocitômetro com água sanitária diluída a 10% e/ou etanol a 70%.
Para extração de DNA ou isolamento de células de Borrelia, centrifugar a cultura de fase exponencial por 10 minutos a 4.000 G e descartar o sobrenadante em um resíduo de risco biológico adequado. Processar as bactérias peletizadas com um kit comercial de extração de DNA ou ressuspendê-las em um meio apropriado para o experimento pretendido. Ao final de cada experimento, esterilizar todos os equipamentos com etanol e radiação UV.
Recolher os resíduos líquidos, incluindo o excesso de cultura, numa garrafa de resíduos e adicionar 10% de água sanitária. Coloque o frasco a 80 graus Celsius antes de descartá-lo. Para armazenamento a longo prazo de culturas de Borrelia, pegue o volume desejado de uma cultura de fase exponencial em 10 milhões a 100 milhões de células por mililitro, adicione 10% de glicerol estéril e misture pipetando para cima e para baixo.
Transfira alíquotas de 1,5 mililitro da mistura para frascos criogênicos de tampa de rosca de dois mililitros. Guarde os frascos para injetáveis de stock a 80 graus Celsius. Mantenha um estoque com pelo menos 10 tubos de cada cepa no freezer, Para cultivar Borrelia de carrapatos duros, colete fêmeas adultas, machos e carrapatos ninfal.
Esterilize os carrapatos mergulhando-os em etanol 70% por dois minutos e seque ao ar em um armário de biossegurança. Em seguida, disseque os carrapatos individualmente em vários pedaços usando um bisturi estéril. Em seguida, coloque os pedaços em um tubo de dois mililitros contendo 1,5 mililitros do meio suplementado com antibióticos.
Incubar as culturas a 34 graus Celsius e verificar a presença de espiroquetas por microscopia de campo escuro ou contraste de fase duas vezes por semana nas primeiras duas semanas e semanalmente após seis semanas. Para cultivar Borrelia a partir de amostras de sangue, remova suavemente o plasma do tubo e inocular um mililitro de plasma em cinco mililitros de meio pré-aquecido, Modified Kelly-Pettenkofer ou MKP Complete. Para o cultivo de Borrelia a partir de uma biópsia de pele, esterilizar a superfície da biópsia de pele com etanol 70% e peróxido de hidrogênio.
Em seguida, colocar a amostra de biópsia em soro fisiológico. Corte a amostra em dois a seis pedaços menores usando uma lâmina de barbear estéril em uma placa de Petri de vidro enquanto imerso no soro fisiológico. Transferir a amostra cortada em cubos e um mililitro de soro fisiológico no qual a biópsia de pele foi armazenada em cinco mililitros de meio pré-aquecido suplementado com antibióticos e incubar a 33 graus Celsius.
Para fazer pratos, aqueça 300 mililitros de meio 1,5x BSK ou MKP Complete sem gelatina. Também aqueça 200 mililitros de 1,7% de agarose a 55 graus Celsius. Misture os líquidos e pipetar 15 mililitros cada em 16 placas de Petri profundas para fazer a camada inferior de ágar.
Mantenha o restante do meio em banho-maria. Quantificar a densidade de cultura de Borrelia e diluir até a densidade desejada em meio líquido. Depois que as placas de fundo tiverem solidificadas, adicione 10 mililitros da mistura restante de ágar como ágar superior a um tubo de 15 mililitros contendo o número apropriado de espiroquetas.
Despeje a suspensão na placa de ágar inferior na placa de Petri rotulada. Depois que as placas estiverem solidificadas, feche-as e coloque-as de cabeça para baixo a 34 a 35 graus Celsius em 2,5% de dióxido de carbono. Quando preparado corretamente, o meio BSK apresentou-se vermelho-alaranjado e límpido.
Para comparação, o meio MKP não inoculado também é mostrado aqui. O crescimento excessivo por bactérias concorrentes gera turbidez e materiais aglomerados no meio. O crescimento bacteriano foi monitorado por inspeção visual por contraste de fase ou microscopia de campo escuro.
Na fase exponencial, as células da Borrelia são tipicamente delgadas, torcidas e modais até certo ponto. À medida que as culturas entram na fase estacionária, os corpos redondos são cada vez mais evidentes. As células de borrelia são fastidiosas e cada espécie e cepa e até mesmo isolado diferem geneticamente e através da adaptação ao hospedeiro do qual foram isoladas.
Ao fazer mídia, ingredientes apropriados fazem uma enorme diferença no vigor da cultura Borrelia ou mesmo na viabilidade da cultura. As espiroquetas de Borrelia são um desafio para a cultura, mas a cultura é possível. A cultura em laboratório é o trampolim para pesquisas sobre a biologia dessas bactérias.
A cultura fornece material para entender o genoma, o proteoma, a evolução e as interações do patógeno hospedeiro das espécies de Borrelia. A cultura da borrelia pode levar várias semanas até que as espiroquetas sejam suficientemente abundantes para detecção. Isso limita os aplicativos de diagnóstico.
Mas a cultura pode mostrar se as espécies de Borrelia estão presentes, viáveis e se replicando, e pode ajudar a acessar tratamentos.
