Este protocolo é significativo porque permite ao usuário gerar um sistema de expressão genômica que pode sofrer emendas alternativas e, neste caso, formar RNAs circulares que podem ser testadas para sua função e associação de doenças. A principal vantagem dessa técnica é que ela abrirá caminho para que outros usem esse protocolo em biologia molecular e clonagem ao estudar emendas alternativas na formação e função circular de RNA. Meu conselho para alguém que experimente essa técnica pela primeira vez seria otimizar as condições do PCR.
Execute gradientes ou realize o PCR de touchdown com diferentes temperaturas de ressarcimento e tempos de extensão. Normalmente fragmentos mais longos ao longo de seis KB estenderão um KB por ciclo e diferentes temperaturas de ressarcial precisarão ser testadas para a melhor amplificação. A demonstração desse método é fundamental porque dará aos usuários uma melhor representação visual dos aspectos mais difíceis do procedimento, especialmente a geração de primers.
Para iniciar este procedimento, carregue o Navegador de Genomas ucsc e use-o para identificar elementos repetitivos necessários para a formação circular de RNA e incorporá-los nos construtos. É importante ressaltar que os primers para amplificação precisam estar fora dos elementos repetitivos. Cole a sequência circular de RNA na pesquisa blat humana e selecione o organismo certo.
Envie a sequência, vá para a visualização do navegador e amplie os temporizadores de 1,5 ou conforme apropriado. Em seguida, mouse sobre os elementos repetitivos para identificar seu subtipo em uma janela flutuante. Elementos Alu estão na linha seno.
Use o botão de faixas padrão sob a janela para redefinir o navegador se uma imagem incorreta for obtida. Primeiro vá ver, DNA na linha superior do Navegador de Genoma uscs para baixar a sequência de DNA mostrada na janela. Na opção de formatação de sequenciamento, selecione opções estendidas de caixa/cor.
Selecione o caso padrão como menor e selecione o caso de alternância para NCBI RefSeq. Selecione sublinhar e em negrito e Itálico para RepeatMasker. Clique em enviar.
Haverá exons como letras maiúsculas e introns como letras minúsculas. Verifique as fronteiras exon/intron. Se o navegador mostrar o complemento reverso, volte e selecione a caixa de complemento reverso até que as bordas exon/intron corretas sejam exibidas.
Em seguida, copie o arquivo com a orientação correta em um documento de processamento de palavras e destaque os exons. Selecione os fragmentos a serem amplificados certificando-se de que o intron não comece ou termine em uma região repetitiva, pois os primers nessas regiões não amplificarão sequências específicas. Para começar, use uma ferramenta web para projetar os primers para clonagem.
Para a sequência vetorial, adicione o local de inserção como o último nucleotídeo e, posteriormente, adicione os fragmentos. Como a numeração do vetor não começa com um determinado local de inserção, o local de inserção no vetor está localizado e a parte a jusante é colocada na frente da sequência upstream. Ajuste os primers se seus pontos de fusão estiverem a mais de quatro graus Celsius de distância e não funcionarem em amplificação.
Neste estudo, os genes repórteres que geram RNAs circulares são clonados e analisados. Os produtos PCR otimizados são separados em um gel de 1% de agarose contendo 1X verde gel. As bandas individuais representam os produtos PCR que serão usados na montagem de DNA enzimático.
Essas bandas são então cortadas do gel e purificadas. O produto PCR purificado não se aplica ao tamanho esperado com verde gel, de modo que os produtos também são separados em um gel de 1%agarose que é posteriormente manchado com brometo de etídio para garantir que os produtos sejam do tamanho correto. Para começar, prepare um kit de montagem de DNA enzimático.
Combine o vetor e insira em uma relação molar de um a dois. Em seguida, adicione 10 microliters de mistura de DNA master mix. Incubar amostras por 60 minutos a 50 graus.
Descongele células competentes no gelo durante a incubação. As células devem estar em um volume de 50 microliters. Em seguida, transforme células competentes com a reação total de montagem.
Adicione dois microliters do produto montado refrigerado às células competentes. Misture movendo suavemente o tubo quatro a cinco vezes. Não vórtice.
Coloque a mistura no gelo por 30 minutos. Aqueça a mistura a 42 graus Celsius por 30 segundos. Em seguida, colocá-lo de volta no gelo por dois minutos.
Depois disso, adicione 950 microliters de mídia SOC de temperatura ambiente ao tubo. Incubar a 37 graus Celsius por 60 minutos enquanto treme a 300 RPM. Durante esta incubação, aqueça duas placas de seleção que contenham o antibiótico apropriado.
Após a incubação, centrifugar o tubo de reação a 10.000 g durante 30 segundos para pelotar as células e emplacar 25% das células em uma placa de seleção e 75% na outra. Incubar essas placas durante a noite a 37 graus Celsius. Antes de começar a transfecção, verifique seu DNA por restrição de digestão.
Aqui, um representante tau minigene que contém exons de nove a 12 é cortado com enzimas de restrição indicadas para descartar grandes recombinações. Para transfecção, primeiro dissolver cloridrato linear de polietileno na água a uma concentração de um miligrama por mililitro no pH dois. Use hidróxido de sódio para levar o pH até sete e filtrar a solução com um filtro de 0,22 micrômetros.
Armazene a solução a quatro graus Celsius até estar pronta para uso. Em seguida, divida as células nos poços de uma placa de seis poços e deixe-as crescer durante a noite na mídia DMEM contendo 10% de FBS. No dia seguinte, aliquot um micrograma do gene relatado em um tubo estéril e adicionar 200 microliters de cloreto de sódio filtrado 150 mililitros.
Misture por vórtice. Em seguida, adicione a solução de polietilenimina a esta mistura a uma proporção de três microliters de polietilenimina para cada um micrograma de DNA. Centrífuga brevemente para coletar amostras na parte inferior do tubo.
Incubar as amostras em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, adicione-o diretamente às células HEK293. Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
No dia seguinte, use um kit de isolamento de RNA para isolar o RNA para RT-PCR. cDNA de duas amostras derivadas de tecidos cerebrais humanos são amplificadas com primers circulares de RNA circ tau exon 1210 reverso e circ tau exon 1211 para a frente. Enquanto a faixa esperada correspondente ao RNA circular tau é vista, as outras bandas fortes são artefatos que não combinam com o genoma humano.
Este experimento é repetido com condições de PCR idênticas, mas a transcrição reversa foi realizada apenas com o primer reverso circ tau exon 1210. Apenas a banda esperada é amplificada e validada através de sequenciamento. O RNA é então tratado com RNase R que remove RNA linear.
O RNA circular é detectável após o tratamento, enquanto o RNA linear não dá mais um sinal detectável. O RNA é isolado 24 horas após a transfecção e analisado pelo RT-PCR. A amplificação do tau linear mRNA mostra duas bandas devido ao splicing alternativo do exon 10.
Sua proporção muda para a expressão excessiva de fatores de emenda. A amplificação do RNA circular 1210 tau mostra a dependência da expressão tau circ RNA na expressão de alguns fatores de emenda, especialmente o CLK2 de quinase semelhante ao Cdc2 e a proteína SR 9G8. A coisa mais importante a se lembrar ao tentar este procedimento é o design e a localização dos primers ao construir um minigene.
O primer não deve estar em elementos repetitivos e precisará ser otimizado em diferentes condições, dependendo do fragmento ser amplificado. Após este procedimento, outros métodos que podem ser realizados serão o teste da função das RNAs circulares. Os usuários podem testar a tradução ou o sequestro de proteínas para identificar uma função para o RNA circular específico que o usuário está interessado.
Essa técnica abriu caminho para a utilização de fragmentos genômicos em um sistema de minigene que pode expressar sobre as RNAs circulares permitindo que o usuário teste e identifique sua função e em alguns aspectos sua associação à doença. A implicação dessa técnica se estende para potenciais terapias e diagnósticos de uma determinada doença, por exemplo, tauopatias, doenças neurodegenerativas associadas à patologia tau. Descobrimos que a proteína associada ao microtúbulo tau, conhecida como MAPT, gera RNAs circulares que acreditamos estar contribuindo para a patologia da doença e esse método nos permite estudar plenamente essas RNAs circulares e identificar sua função e relação com a doença.
Esse método poderia fornecer uma visão sobre uma melhor compreensão das RNAs circulares, quais são suas funções e o papel que podem desempenhar em certas doenças. Este método pode ser aplicado na clonagem de outros minigenes que expressam RNAs circulares entre espécies onde ele pode fornecer insights sobre sua função. A amplificação dos produtos PCR prova ser a mais difícil com fragmentos longos amplificados a partir do DNA genômico, juntamente com múltiplos elementos repetitivos dentro do fragmento.
