Nosso design híbrido de microdrive permite que os experimentadores não apenas regis téramicos, mas também escolham diferentes tipos de eletrodos para otimizar o rendimento e a estabilidade. Combinamos nove tetrodes, uma sonda linear de silício e fibra óptica que são ajustáveis e reutilizáveis em uma matriz de microdrive para experimentos in vivo com ratos em movimento livre. Esta técnica pode ser facilmente adaptada a outros animais maiores, como ratos ou saguis.
As sondas de silício são extremamente frágeis. Precisamos ter cuidado ao lidar com as sondas, por exemplo, ao adaptar a fibra óptica e ao girar o conjunto de transporte para o microdrive. A matriz de microdrive consiste em cinco partes.
Para preparar o parafuso de microdrive para a sonda de silício primeiro imprima um padrão plástico do microdrive e coloque fita em torno do padrão para fazer uma parede temporária ao redor do padrão. Despeje gel de silício líquido no padrão e remova bolhas de ar com agitação suave. Quando o silício estiver curado, remova cuidadosamente o molde de gel de silício do padrão.
Em seguida, use um moedor rotativo para cortar 18 e 9,5 mm de comprimentos de tubo de aço inoxidável de 23 medidores e use o moedor para endurecer a parte superior 2 a 3mm dos tubos. Aplique um pequeno volume de óleo de silício em um parafuso personalizado e ajuste os tubos e aparafuse no molde. Despeje acrílico dentário no molde e use uma seringa para eliminar quaisquer bolhas de ar ao redor dos tubos e do parafuso.
Quando o acrílico dentário tiver curado completamente, remova o parafuso do microdrive do molde e use um alicate para dobrar 6mm de uma extremidade da ponta do fio de 18mm para um ângulo de 60 graus. Usando uma ferramenta de giro, gire o parafuso do microdrive para verificar a qualidade e, em seguida, instale o parafuso de microdrive na carroceria do microdrive e gire o parafuso para verificar se ele é capaz de se mover para cima e para baixo suavemente. Para preparar a nave auxiliar para a sonda de silício use uma tesoura afiada para cortar dois comprimentos de 5mm de PEEK e alinhar os tubos em ambos os lados da nave auxiliar.
Cole os tubos na nave auxiliar com epóxi e aplique um pequeno volume de óleo de silício nos postos-guia. Quando o epóxi secar, coloque o transporte sobre os postes-guia do corpo de matriz de microdrive para verificar a qualidade. A nave deve se mover suavemente sem atrito excessivo.
Para preparar o optorode use um cortador Rubi para cortar um pedaço de fibra óptica até 21mm de comprimento e moer a ponta de fibra até ficar plana e brilhante. Quando a ponta estiver pronta, coloque suavemente a fibra óptica na parte frontal da sonda de silício 200 a 300 micrômetros acima do topo dos locais do eletrodo e proteja temporariamente a fibra com fita transparente e cole a fibra óptica na base da sonda de silício com um pequeno volume de epóxi e deixe que o epóxi cure por cinco horas. Para anexar a nave auxiliar à sonda de silício aplique um pequeno volume de epóxi na parte de trás da base da sonda de silício e segure suavemente a parte inferior da nave auxiliar contra a base da sonda de silício por dois a três minutos para evitar a formação de uma lacuna entre a nave auxiliar e a base da sonda de silício.
Quando o epóxi tiver curado completamente segure o sulco da nave com pinças finas e use um microscópio para colocar cuidadosamente os tubos de transporte nos postos-guia do corpo principal. Gire o parafuso para inserir o parafuso de microdrive no orifício do parafuso e insira a ponta do tubo em forma de L na ranhura da cabeça da nave auxiliar para engatar a sonda de silício e o parafuso de microdrive. Em seguida, corte dois parafusos número 0 para um comprimento de rosca de 3,5 mm e triture as pontas para remover as rebarbas.
Coloque o suporte do conector da sonda no corpo da matriz e insira o conector elétrico da sonda de silício no suporte. Insira os parafusos número 0 para segurar o suporte do conector da sonda. Use epóxi para fixar o conector da sonda de silício no suporte, tomando cuidado para não colar a sonda no corpo do array microdrive.
Para fixar o suporte da ferrule à sonda opto-silicon e ao corpo de matriz de microdrive, corte dois parafusos número 0 em um comprimento de rosca de 6 mm e triture as pontas. Triture a parte externa de duas porcas de parafuso de máquina número 0 para fazer pequenas porcas de hexálida com diâmetros externos de 2,5 a 3 mm e insira o parafuso número 0 no componente A do suporte. Cole as cabeças de parafuso com epóxi.
Aplique um pequeno volume de graxa de silício nos componentes A e B para reduzir o atrito com o corpo. Use pinças inversas para inserir temporariamente o componente A no corpo e coloque o componente B sobre os parafusos do componente A.Coloque as porcas personalizadas nos parafusos e use um alicate para apertar as porcas para fixar o suporte da ferrula no corpo. Insira a ferrule de fibra no sulco do suporte de ferrule de fibra, tomando cuidado para que a ferrule de fibra esteja furando de 4 a 5 mm do suporte.
Aplique uma pequena quantidade de epóxi entre a ferrula e o sulco do suporte. Quando o epóxi estiver curado, solte as porcas e gire o parafuso do microdrive para verificar a escote e o suporte da ferrula para um movimento suave, então confirme que a ponta da sonda se retrai completamente no corpo quando o suporte da ferrula estiver na posição superior e os tubos de transporte ainda estejam associados aos postes-guia. Para fixar o cone de proteção, aperte dois parafusos número 0 de 3,5 mm do lado de fora do cone para manter o microdrive no lugar.
O conjunto de microdrives pode ser configurado dentro de cinco dias se a construção for concluída de acordo com o cronograma descrito na tabela. Após o ajuste do tetrode, o desempenho comportamental pode ser testado em uma pista linear e em um campo aberto. Em ambos os tipos de experimentos, o mouse é autorizado a explorar livremente por aproximadamente 30 minutos, enquanto os sinais eletrofisiológicos são gravados sem ruído severo relacionado ao movimento durante toda a sessão de gravação.
A estimulação da luz pode então ser realizada no córtex entorhinal medial para estimular os neurônios do córtex entorhinal medial camada 3 que projetam para o subcampo CA1 do hipocampo. Atividades espontâneas de espeto e potenciais de campo locais são então registradas a partir dos tetrodes e da sonda de silício quando o rato está dormindo. Neste experimento representativo, os potenciais de campo esquerdo registrados nos tetrodes demonstraram grandes atividades de ondulação sugerindo que todos os tetrodes estavam posicionados nas proximidades da camada de células piramida CA1.
As atividades responsivas induzidas pela luz neste ensaio foram observadas pela primeira vez no córtex entorhinal medial seguido de atividades dentro do CA1 com 13 a 18 milissegundos de latência. Tome cuidado para inserir a sonda opto-silicon no corpo de microdrive em um ambiente livre eletrostático. O Cone de blindagem pode ser substituído por materiais como uma folha de papel e fita.
Isso diminuirá a taxa do microdrive em até 20% Nosso design de microdrive fornece opções flexíveis para uma combinação eficaz de eletrodos de gravação para medir e manipular múltiplas regiões cerebrais e investigar a dinâmica e interações de diferentes estruturas cerebrais.
