Il nostro design ibrido microdrive consente agli sperimentatori non solo di registrare da più regioni cerebrali, ma anche di scegliere diversi tipi di elettrodi per ottimizzare la resa e la stabilità. Abbiamo combinato nove tetrodi, una sonda lineare al silicio e fibre ottiche regolabili e riutilizzabili in un array di microdrive per esperimenti in vivo con topi che si muovono liberamente. Questa tecnica può essere facilmente adattata ad altri animali più grandi come ratti o marmotte.
Le sonde di silicio sono estremamente fragili. Dobbiamo stare attenti quando abbiamo a che fare con le sonde, ad esempio, quando adattiamo la fibra ottica e quando si ruota il gruppo navetta nel microdrive. L'array di microdrive è composto da cinque parti.
Per preparare la vite del microdrive per la sonda di silicio, stampare prima in 3D un motivo plastico del microdrive e posizionare il nastro attorno al modello per creare una parete temporanea intorno al modello. Versare gel di silicio liquido nel modello e rimuovere le bolle d'aria con delicati scuotimenti. Quando il silicio è stato polimerinato, rimuovere con cura lo stampo in gel di silicio dal modello.
Successivamente utilizzare una smerigliatrice rotante per tagliare lunghezze di 18 e 9,5 mm di tubo metallico in acciaio inossidabile calibro 23 e utilizzare la smerigliatrice per sgrossare i primi 2-3 mm dei tubi. Applicare un piccolo volume di olio di silicio su una vite personalizzata e impostare i tubi e la vite nello stampo. Versare l'acrilico dentale nello stampo e utilizzare una siringa per eliminare eventuali bolle d'aria intorno ai tubi e alla vite.
Quando l'acrilico dentale è completamente polimero, rimuovere la vite del microdrive dallo stampo e utilizzare pinze per piegare 6 mm da un'estremità della punta del filo da 18 mm a un angolo di 60 gradi. Utilizzando uno strumento di tornitura ruotare la vite del microdrive per verificare la qualità, quindi installare la vite del microdrive nel corpo dell'array di microdrive e ruotare la vite per verificare se è in grado di muoversi su e giù senza intoppi. Per preparare la navetta per la sonda di silicio utilizzare forbici affilate per tagliare due lunghezze di 5 mm di PEEK e allineare i tubi su entrambi i lati dello shuttle.
Incollare i tubi alla navetta con epossidico e applicare un piccolo volume di olio di silicio sui posti guida. Quando l'epossidico si è asciugato, posizionare la navetta sopra i posti guida del corpo dell'array di microdrive per verificare la qualità. La navetta dovrebbe muoversi senza intoppi senza attrito eccessivo.
Per preparare l'optorode utilizzare una fresa Rubi per scindere un pezzo di fibra ottica a 21 mm di lunghezza e macinare la punta della fibra fino a quando non è piatta e lucida. Quando la punta è pronta, posizionare delicatamente la fibra ottica sul lato anteriore della sonda di silicio da 200 a 300 micrometri sopra la parte superiore dei siti dell'elettrodo e fissare temporaneamente la fibra con nastro trasparente, quindi incollare la fibra ottica alla base della sonda di silicio con un piccolo volume di epossidico e consentire all'epossidico di polimerizzarsi per cinque ore. Per collegare la navetta alla sonda di silicio applicare un piccolo volume di epossidico sul retro della base della sonda di silicio e tenere delicatamente la parte inferiore dello shuttle contro la base della sonda di silicio per due o tre minuti per evitare la formazione di uno spazio tra la navetta e la base della sonda di silicio.
Quando l'epossidico si è completamente polimerizzato tenere la scanalatura della navetta con pinzette fini e utilizzare un microscopio per posizionare con cura i tubi navetta sui posti guida del corpo principale. Ruotare la vite per inserire la vite del microdrive nel foro della vite e inserire la punta del tubo a forma di L nella scanalatura della testa dello shuttle per innestare la sonda di silicio e la vite del microdrive. Quindi tagliare due viti numero 0 a una lunghezza del filetto di 3,5 mm e macinare le punte per rimuovere le bave.
Posizionare il supporto del connettore della sonda sul corpo dell'array e inserire il connettore elettrico della sonda di silicio nel supporto. Inserire le viti numero 0 per contenere il supporto del connettore della sonda. Utilizzare epossidico per fissare il connettore della sonda di silicio nel supporto facendo attenzione a non incollare la sonda al corpo dell'array di microdrive.
Per collegare il porta ferrule alla sonda opto-silicio e al corpo dell'array di microdrive, tagliare due viti numero 0 a una lunghezza del filetto di 6 mm e macinare le punte. Macinare l'esterno di due dadi a vite della macchina numero 0 per realizzare piccoli dadi esagonale con diametri esterni da 2,5 a 3 mm e inserire la vite numero 0 nel componente A del supporto. Incollare le teste delle viti con epossidico.
Applicare un piccolo volume di grasso di silicio sui componenti A e B per ridurre l'attrito con il corpo. Utilizzare pinzette inverse per inserire temporaneamente il componente A nel corpo e posizionare il componente B sulle viti del componente A.Infilare i dadi personalizzati sulle viti e utilizzare pinze per stringere i dadi per fissare il portavite sul corpo. Inserire il ferrule in fibra nella scanalatura del portaregola in fibra facendo attenzione che il ferrule in fibra si attacchi da 4 a 5 mm dal supporto.
Applicare una piccola quantità di epossidico tra il ferrule e la scanalatura del supporto. Quando l'epossidico è polimerizzato, allentare i dadi e ruotare la vite del microdrive per controllare la navetta e il porta ferrule per un movimento fluido, quindi confermare che la punta della sonda si ritrae completamente nel corpo quando il portaregola si trova nella posizione superiore e i tubi navetta sono ancora associati ai posti guida. Per fissare il cono dello scudo, fissare due viti numero 0 da 3,5 mm dall'esterno del cono per tenere il microdrive in posizione.
L'array di microdrive può essere impostato entro cinque giorni se la costruzione viene completata in base alla sequenza temporale delineata nella tabella. Dopo la regolazione del tetrodo le prestazioni comportamentali possono essere testate su una pista lineare e in un campo aperto. In entrambi i tipi di esperimenti il mouse può esplorare liberamente per circa 30 minuti mentre i segnali elettrofisiologici vengono registrati senza rumori gravi legati al movimento durante la sessione di registrazione.
La stimolazione della luce può quindi essere eseguita alla corteccia entorinale mediale per stimolare i neuroni mediali della corteccia entorinale strato 3 che si proiettano nel sottocampo CA1 dell'ippocampo. Le attività spontanee di spiking e le potenzialità di campo locali vengono quindi registrate dai tetrodi e dalla sonda di silicio quando il mouse dorme. In questo esperimento rappresentativo i potenziali di campo sinistro registrati nei tetrodi hanno dimostrato grandi attività a catena suggerendo che tutti i tetrodi erano posizionati in prossimità dello strato cellulare piramidale CA1.
Le attività reattive indotte dalla luce in questo saggio sono state osservate per la prima volta nella corteccia entorinale mediale seguite da attività all'interno di CA1 con 13-18 millisecondi di latenza. Fare attenzione a inserire la sonda opto-silicio nel corpo del microdrive in un ambiente privo di elettrostatica. Il cono di schermatura può essere sostituito con materiali come un foglio di carta e nastro adesivo.
Ciò ridurrà la velocità del microdrive fino al 20%Il nostro design microdrive offre scelte flessibili per una combinazione efficace di elettrodi di registrazione per misurare e manipolare più regioni cerebrali e per indagare le dinamiche e le interazioni delle diverse strutture cerebrali.
